Antimicrobial Activity of Cyanobacteria using In-Vitro and In Silico ...

2 downloads 0 Views 604KB Size Report
Jan 31, 2013 - understand high reactive responses of various drugs administered for the oral candidiasis. The drugs are being compared with the SAP.
                                                             

 

 

 

 

 

 

          ISSN 2319 – 2739 

           

 

 

 

                                                              Int J Med Biosci. 2013; 2(1): 09 ‐ 15   

                        International Journal of Medicine and Biosciences                                                                           www.ijmbonline.com 

Antimicrobial Activity of Cyanobacteria using In‐ Vitro and In Silico Analysis   Vijayakumar Madhumathi and Subramaniyan Vijayakumar*   *Department of Botany and Microbiology, A.V.V.M Sri Pushpam College (Autonomous),   

Poondi‐613 503, Thanjavur.    Received 10 November 2o12; accepted 24 December 2012; published online 31 January 2013 

Research Article                                                                                                                                                                                            Microbiology  Abstract  Cyanobacteria  have  immense  medicinal  importance  and  are  therefore  used  in  the  treatment  of  bacterial  and  fungal  organism  causing oral diseases. GC‐MS   analysis of the ethanolic extract of the Oscillatoria laete‐virens and Lyngbya martensiana has resulted in  the  identification  bioactive  compound.  The  human  oral  cavity  is  a  complex  biological  system  in  which  members  of  a  microbial  community  interact  with  themselves  as  well  as  with  different  host  structures  and  components  of  Candida  albicans  and  Streptococcus  mutans.  The pathogenesis of this dental infection is a multi‐factorial process that results in a serious degenerative disease of the Oral  candidiasis. In the present study SAP (Secreted Aspartyl Proteinases in Virulence and Pathogenesis) is taken as a case study molecule to  understand high reactive responses of various drugs administered for the oral candidiasis. The drugs are being compared with the SAP  from Candida albicans and SpaP (cell surface antigen SpaP gene) from Streptococcus mutans. The SAP and SpaP interacted with formic  acid, nerolidal, octanol and nonanoic acid using docking methods.  Keywords: Cyanobacteria, bioactive compound, candidiasis, GC‐MS, docking  

Introduction  Cyanobacterial  blooms  have  a  wide  range  of  social  environmental  and  economic  impacts.  Cyanobacterial  metabolites  which  are  cytotoxic  to  other  algae  are  of  special  interest.  On  the  other  hand,  such  compounds  could  provide  helpful  in  combating  algae  blooms  or  in  the  development  of  environmentally  friendly  are  tributilin free antofouling parts of ships. The knowledge  about  such  compounds  gives  a  better  understanding  of  interaction  between  competing  organisms  of  the  same  habitat.  Furthermore,  cyanobacterial  biogenics,  particularly cyotoxic compounds could provide leads for  further  development  of  new  therapeutic  agents  for  a  variety  of  disease  and  for  the  development  of  new  antibiotics.  [1,2].  The Study was designed to investigate  the  Antimicrobial  activity  of  cyanobacterial  species  Oscillatoria  laete‐virens  and    Lyngbya  martensiana.  The  study  was  extended  to  identify  the  individual  components  of  their  ethanolic  extract  by  Gas  chromatography  (GC)  coupled  with  Mass  Spectrometry  (MS).  *Corresponding Author  E‐mail: [email protected]  ©Copyright 2012, International Journal of Medicine and Biosciences   All Rights Reserved 

In  oral  cavity  of  human  beings,  Oral  candidiasis  diseases  are  of  common  occurrence.  It  is  the  inflammatory  condition  of  the  supporting  tissues  of  the  teeth  caused by  bacteria  and  fungi.  The  oral  microbiota  is  a  complex  community  of  microorganisms.  They  function as multiple pathogens in the affected site. Oral  disease,  caused  mainly  by  microbes,  is  characterized  by  inflammation,  a  strong  immune  response  and  loss  of  connective  tissue  attachment  and  bone  disease  is  an  infection  of  the  supporting  structures  of  the  teeth.  The  oral  diseases  are  treated  with  antibiotics  and  anti‐ therapeutics  by  the  oral  physicians.  Even  though,  many  antibiotics  are  administered,  the  nature  of  the  response  is  different  .To  identify  the  suitable  drugs  against  the  pathogenic  microorganisms,  insilico  analysis  is  carried  out  in  the  recent  past.  In  the  present  study,  Candida  albicans  and  Streptococcus  mutans  have  been  selected  for the insilico analysis to assess the suitable drug for the  disease called oral candidiasis.  In  the  present  study  SAP  and  SpaP  molecules  is  taken  as  a  case  study  molecule  to  understand  high  reactive responses of various drugs administered for the  oral candidiasis. The drugs are being compared with the  SAP and SpaP. The SAP and SpaP interacted with formic  acid, nerolidal, octanol and nonanoic acid using docking  

                                                V. Madhumathi and S. Vijayakumar / Int J Med Biosci. 2013; 2(1): 09 ‐ 15                                         10  methods.  The  present  application  of  computational  biology and bioinformatics has the potential, not only of  speeding  up  the  drug  discovery  process  but  also  of  changing the drugs design.  Materials and Methods  Study Area  Two  Cyanobacterial  strains  were  selected  for  screening  of  their  antimicrobial  activity  Oscillatoria  laete‐virens  and  Lyngbya  martensiana  from  Samuthiram  Lake  Thanjavur,  Tamilnadu,  India.  The  algal  species  were maintained in BG11 medium at a temperature [3, 4,  5,  6,  7  &8]  subcultured  in  BG11  medium  [9]  of  25  ±  1°C  under  continuous  illumination  (2500  lu  for  60  μmol.m‐ 2s‐1)  for  12  days.  Cyanobacterial  cells  were  collected  by  centrifugation  in  the  exponential  growth  phase  (after  12  days),  washed  with  distilled  water  and  the  pellets  were  dried at room temperature.   Chemical composition (GC‐MS analysis)   The  Gas  chromatography  mass  spectrometry  (GC‐ MS)  analysis  of  the  samples  isolated  from  the  ethanolic  extract  of  such  as  Oscillatoria  laete‐virens  and    Lyngbya  martensiana  was  performed  using  a  Shimzdu  Mass  Spectrometer‐2010 series system (AIRF, JNU, New Delhi)  equipped with a AB inno‐wax column (60 m × 0.25 mm  id,  film  thickness  0.25  μm).  For  GC‐MS  detection,  an  electron  ionization  system  with  ionization  energy  of  70  eV  was  used.  Helium  gas  was  used  as  a  carrier  gas  at  a  flow rate of 1.2 ml per minute. Injector and mass transfer  line  temperature  were  set  at  270  and  280°C.  The  compounds were identified by comparing them with the  standards, or the mass spectra were matched with the in  built library (NIST/Wiley).   Molecular Docking  The  various  oral  pathogenic  microorganisms  Candida  albicans  and  Streptococcus  mutans  were  selected  for  the  study:  In  the  above  organisms,  pathogenic protein, causing oral candidiasis, such as SAP  and SpaP was selected for the present docking study for  finding  the  best  drug  to  be  administered  for  the  oral  candidiasis.  For  the  present  protein‐ligand  docking  the  following  drugs  were  identified  to  act  as  ligands  formic  acid,  nerolidal,  octanol  and  nonanoic  acid.  The  PDB  (Protein  Data  Bank)  is  the  single  worldwide  archive  of  Structural data of Biological macromolecules, established  in  Brookhaven  National  Laboratories  (BNL)  in  1971  6.  It 

contains  Structural  information  of  the  macromolecules  determined by X‐ray crystallographic, NMR methods etc.  http://  www.ncbi.  lm.nih.  gov  /  PubMed.  These  specialized  databases  are  funded  by  the  National  Institute  of  Dental  and  Craniofacial  Research  (NIDCR)  within  the  National  Institutes  of  Health,  Bethesda  Maryland (http://www.oralgen.lanl.gov/). 

Hex  is  an  interactive  protein  docking  and  molecular  superposition  program,  written  by  Dave  Ritchie Molecular docking is a study of how two or  more  molecular  structures,  for  example  drug  and  enzyme  or  receptor  of  protein,  fit  together  Molecular  docking  softwares  are  mainly  used  in  drug research industry. The most interesting case is  the  protein‐ligand  interaction,  because  of  its  applications  in  medicine.  Ligand  is  a  small  molecule,  which  interacts  with  protein's  binding  sites.  The  Protein‐Ligand  interaction  plays  a  significant  role  in  structural  based  drug  designing.  In  our  research  work  we  have  taken  the  SAP  (Candida  albicans  Secreted  Aspartyl  Proteinases  in  Virulence  and  Pathogenesis)  and  SpaP  (spaP  gene  of  Streptococcus  mutans  in  dental  plaque  and  its  relationship  with  early  childhood  caries)  receptor  and  the  cyanobacterial  bioactive  compounds  using  as  drugs  against  oral  candidiasis.  The  receptor  was  docked  to  the  above  said  drugs  and  the  energy  value obtained using the HEX docking software.  Results   The  GC‐MS  spectral  results  and  comparison  of  results  with  library  search  successfully  enabled  the  identification of the thirty compounds. The structures of  all compounds were identified and detail given in (Table  1&  Fig‐  1,  2)  Among  the  30  compounds  8  compounds  such very essential in order to bioactive compound with  refered to molecular docking.  The  two  organisms  Candida  albicans  and  Streptococcus  mutans  caused  oral  candidiasis,  a  disease  encompassing  a  large  of  inflammatory  and  destructive  conditions  of  the  tissue  surrounding  the  teeth.  These  bacteria after colonizing around the teeth in the gingival  crevice , tissue damage has taken place by a combination  of  direct  action  of  toxic  bacterial  products  that  include  endotoxins and hydrolytic enzymes.    

                                                V. Madhumathi and S. Vijayakumar / Int J Med Biosci. 2013; 2(1): 09 ‐ 15                                         11  S. No    1  2.  3.  4.  5  6.  7  8  9  10  11  12  13  14  15    1  2.  3.  4.  5  6.  7  8  9  10  11  12  13  14  15 

Compound name   Oscillatoria laete‐virens   Ethanoic acid  Formic acid   Octanal  3,7,11‐Trimethyl‐1,6,10‐dodecatrien‐3‐ol  Bicyclo[10.1.0]tridecane  Heptanol  Nanonal  Octadecanol  1,1‐Diethoxypropanal  (Z)‐1,7‐Octadadiene  1‐Undecanol (CAS)  1‐Tetradecanol (CAS)  1‐Tridecene (CAS)  Cyclohexyl 4‐cyanobutanoate  1‐Heptadecene (CAS)  Lyngbya martensiana  1‐Heptanol  Formic acid   Ethaneloic acid  Dihydrodiplodialide  D3‐methyNitrate  Cyclododecylhydroperoxide  1‐Dodecanol  Octadecanol  2‐Octenal, (E)‐ (CAS)  6‐Iodo‐1‐heptene  1‐Nonadecanol  Neopentyl 2‐oxobutanoate  Heptane (CAS)  1‐Hexadecanol (CAS)  NANONIC ACID 

Retention time(min) 

Area (%) 

45.1  3.44  10.09  12.6  3.04  6.00  6.00  17.88  6.62  9.29  13.78  17.88  17.88  24.20  26.76 

24.12  24.12  0.66  2.44  2.44  1.12  1.12  1.07  0.32  0.34  1.12  1.76  1.76  0.34  1.89 

9.29  6.24  13.68  9.24  3.04  10.7  6.00  9.29  10.07  10.07  17.86  21.10  21.10  23.30  15.33 

9.24  24.12  0.38  0.81  13.68  0.85  0.81  0.68  0.86  0.86  2.35  6.05  0.65  2.03  2.56 

  Table.1. GC‐MS Analysis of the components in ethanolic extracts of cyanobacteria   

  Fig.1. GC‐MS Chromatogaram of ethanolic extract of cyanobacteria Oscillatoria laete‐virens    

                                                V. Madhumathi and S. Vijayakumar / Int J Med Biosci. 2013; 2(1): 09 ‐ 15                                         12  Enzymes play an important role in disease making.  Enzymes are the functional proteins, which is controlled  by small molecules called ligands. These small molecules  act  as  switches  to  turn  on  or  off  of  the  protein  to  function.  The  Protein‐Ligand  interactions  play  a  significant role in the identification of suitable drugs for  suitable disease to the pathogens. Computational biology  and  bioinformatics  have  the  potential  not  only  for  speeding  up  the  drug  discovery  process,  but  also  of  changing the way drugs are designed. It involves variety  of methods to identify novel compounds.  One  such  method  is  docking  of  the  drug  molecule  with  receptor  in  the  protein.  Docking  in  process  by  which  two  molecules  fit  together  in  3D  space.  To  perform docking software packages of various kinds have  been  used.  One  such  software  packaged  is  here.  In  this  investigation Hex is used for docking of drug molecules  with the receptor molecules of SAP and SpaP. Molecular  docking is like a “lock‐and‐key”, where one is interested  in  finding  the  correct  relative  orientation  of  the  “key”  which  will  open  up  the  “lock”.  In  the  present  study  the  proteins SAP and SpaP is the lock and the ligand (Drugs)  is the key.   

The ligand molecule is the smaller one. In this study  the  drug  molecules  are  the  ligands.  In  the  docking  process the SAP and SpaP molecules is larger size while  the  ligand  drug  molecule  is  very  smaller.  The  focus  of  molecular  docking  is  to  computationally  simulate  the  molecular  recognition  process.  The  aim  of  molecular  docking  is  to  achieve  an  optimized  conformation  for  both  the  protein  and  ligand  and  relative  orientation  between protein and ligand such that the free energy of  the overall system is minimized.  Docking  results  tabulated  between  the  SAP  and  SpaP of Candida albicans and Streptococcus mutans with  the drugs. Initially the SAP receptor of Candida albicans  was docked with the drug molecule, formic acid. The e‐ value obtained was ‐64.91. Then the same drug molecule  was  docked  with  SpaP  of  Streptococcus  mutans  the  e‐ value  obtained  –  50.57.  Among  the  four  drugs  above  energy  values  given,  the  drug  nerolidal  showed  better  energy  value  than  that  of  other  three  drugs.  The  SAP  receptor  molecule  of  Candida  albicans  was  docked  with  the  above  three  drugs  to  identify  the  better  drug.   Among  the  four,  nerolidal  showed  high  energy  value  (‐ 80.37)  than  that  of  other  three  drugs.  In  the  case  of  Streptococcus  mutans,  the  e‐value  was  ‐56.57  (Table‐2&  Fig‐3, 4). 

   

                     Fig.2. GC‐MS Chromatogaram of ethanolic extract of cyanobacteria‐ Lyngbya martensiana 

 

                                                V. Madhumathi and S. Vijayakumar / Int J Med Biosci. 2013; 2(1): 09 ‐ 15                                         13    S.NO   

E‐Value 

 

Nerolidal  Octonal 

‐73.74  ‐78.99 

 

Nanonic acid 

‐80.37 

Formic acid 

‐55.63 

nerolidal 

‐ 56.57 

Octonal 

‐51.77 

Nanonic acid 

‐50.57 

Streptococcus mutans 

SAP 

Bio active  compound 

‐ 64.91 

2. 

Candida albicans 

Pathogenic  enzyme 

Formic acid 

 

1. 

Pathogenic  Organism 

SpaP 

     

Table. 2. HEX  e‐ Value of Bioactive pathogenic enzyme interaction   

                                                      

 

Fig. 3. Bioactive Pathogenic Enzyme Interaction. SAP – Nanonic acid interaction     

  Fig.4. SpaP – Nerolidal interaction   

 

                                                V. Madhumathi and S. Vijayakumar / Int J Med Biosci. 2013; 2(1): 09 ‐ 15                                         14  Discussion  The  antimicrobial  activity  of  algal  compounds  extracted  from  algae  depends  upon  the  type  of  solvent  used for extraction. The present study revealed that the  use  of  organic  solvents  in  the  preparation  of  algal  extracts  provide  more  consistent  antimicrobial  activity.  This  observation  clearly  indicates  that  the  polarity  of  antimicrobial  compounds  make  them  more  readily  extracted  by  organic  solvents  and  using  organic  solvent  does  not  negatively  affect  their  bioactivity  against  antibacterial and antifungal species. Many investigations  mentioned  that  the  methanol  extracts  of  Nostoc  muscorum  revealed  antibacterial  activity  on  Sclerotinia  sclerotiorum. Also the methanolic extract of a blue green  algae  has  been  investigated  for  in  vitro  antimicrobial  activity  against  Proteus  vulgaris,  Bacillus  cereus,  Escherichia  coli,  Pseudomonas  aeruginosa,  Aspergillus  niger,  Aspergillus  flavus  and  Rhizopus  nigricans  using  agar cup diffusion method. The antimicrobial activity of  methanolic extract of S. platensis was also explained due  to  the  presence  of  γ‐  Linolenic  acid  and  compound  was  also present in the methanol extract in the present study  as  observed  by  GC‐MS  analysis.  Previous  publications  reported  that  the  compounds  such  as  formic  acid,  nerolidal, octanol and nonanoic acid were found in both  algae  and  plants  show  anticancer,  antioxidant  and  antimicrobial activity [10, 11].  

Docking  plays  an  important  role  in  the  rational  design  of  drugs.  Therefore  the  molecular  docking  is  biologically  and  pharmaceutically  gains  significance.  A  binding interaction between a small molecule ligand and  an enzyme protein may result in activation or inhibition  of the enzyme.  Docking is most innovative method used in the field  of drug design. Most drugs are small organic molecules,  and also docking is possible with these molecules. In the  present study, docking analysis of Formic acid, nerolidal,  Octonal  and  Nanonic  acid  was  carried  by  HEX  In  this  way  the  pharmacophoric  part  of  the  drug  was  partially  identified.   Acknowledgement  The  authors  are  thankful  to  the  management  of  A.V.V.M.  Sri  Pushpam  College  (Autonomous),  Poondi,  for  providing  them  necessary  facilities  and  support  to  carry out this work. 

  References  [1] 

Borowitzka  MA  (1995).  Microalgae  as  source  of  pharmaceuticals and other biologically active compounds. J.  Appl. Phycol., 7: 3‐15. 

[2] 

Venkataraman  G.S.,  S.  K.  Goyal,  B.  D.  Kaushik  And  P.  Roychoudhury,  1974.  Algae  Form  and  Function.  Today  and  Tomorrows Publishers, New Delhi, pp 186. 

Antimicrobially  active  lipids  and  active  fatty  acids  are  present  in  a  high  concentration  in  this  algae.  It  was  hypothesized  by  [12]  that  lipids  kill  microorganisms  by  leading to disruption of the cellular membrane as well as  bacteria, fungi and yeasts because they can penetrate the  extensive  meshwork  of  peptidoglycan  in  the  cell  wall  without  visible  changes  and  reach  the  bacterial  membrane  leading  to  its  disintegration.  Present  investigations  is  contradictory  with  the  results  of  other  studies [13,14] may be due to the production of bioactive  compounds  related  to  the  seasons,  method,  organic  solvents used for extraction of bioactive compounds. 

[3] 

Anagnostidis K.  And J. Komárek, 1988. Modern approach to  classification system of cyanophytes. 3. Oscillatoriales. Arch.  Hydrobiol., Algol. Studs. 50‐53: 327‐ 472. 

[4] 

Cronberg  G.  And  J.  Komárek,  2004.  Some  nostocalean  cyanoprokaryotes  from  lentic  habitats  of  Eastern  and  Southern Africa. Nova Hedwigia 78: 71 – 106. 

[5] 

Desikachary T.V. 1959. Cyanophyta. I. C. A. R. Monograph on  Algae. New Delhi. PP. 686 pp. 

[6] 

Komárek J. 2005. Studies on the cyanophytes (Cyanobacteria,  Cyanoprokaryota)  of  Cuba  11.  freshwater  Anabaena  species.  Preslia, Praha 77: 211 – 234. 

[7]  

Kant, S. and P. Gupta, 1998. Algal flora of Ladakh. Scientific  Publication, Jodhpur, India, pp. 341. 

Bioinformatics is seen as an emerging field with the  potential  to  significantly  improve  how  drugs  are  found,  brought  to  the  clinical  trials  and  eventually  released  to  the  marketplace.  Streptococcus  mutans  and  Candida  albicans  is  used  by  pathogenic  bacteria  and  to  absorb  iron  from  the  host  environment.  This  pathogen  relies  upon  siderophore‐independent  iron  acquisition  from  host  proteins  for  its  survival.  SAP  and  SpaP  binds  with  extremely high affinity  

[8] 

Ramanathan  K.R.  1964.  Ulotrichales.  I.C.A.R.  monograph,  New Delhi, pp. 183.  

[9] 

Rippka R., J. Deruelles, J. B. Waterbury, M. Herdman And R.  Y.  Stanier,  1979.  Generic  assignments,  strain  histories  and  properties  of  pure  cultures  of  cyanobacteria.  J.  Gen.  Microbiol. 111: 1 – 61. 

[10] 

 Lee  YS,  Kang  MH,  Cho  YS,  Jeong  CS  (2007).  Effects  of  constituents of Pharm. Res amomum xanthioides on gastritis  in rats and on growth of gastric cancer cells. Arch.., 30: 436‐ 443. 

                                                V. Madhumathi and S. Vijayakumar / Int J Med Biosci. 2013; 2(1): 09 ‐ 15                                         15   [11] 

[12] 

[13]  

[14] 

Mishra PM, Sree A (2007). Antibacterial Activity and GCMS  Analysis  of  the  Extract  of  Leaves  of  Finlaysonia  obovata  (A  Mangrove Plant). Asi. J. Pl. Sci., 6: 168‐172. 

[3] 

http://www.rcsb.org/ 

[4]  

http://www.oralgen.lanl.gov/ 

Lampe MF, Ballweber LM, Isaacs CE, Patton DL, Stamm WE  (1998).  Killing  of  Chlamydia  trachomatis  by  novel  antimicrobial  lipids  adapted  from  compounds  in  human  breast milk. Antimicro. Agents Chemo., 45: 1239‐1244. 

[5]  

http://www.umass.edu/microbio/rasmol. 

[6]  

http://www.redpoll.pharmacy.ualberta.ca/drugbank/ 

[7]  

http://www.umass.edu/microbio/rasmol. 

[8]  

http://www.biochem.abdn.ac.uk./hex 

[9]  

http:// www.expasy.org/prosite 

[10]  

http://molprobity.biochem.duke.edu/index.php? 

[11]  

http:// www.americanheart.org 

Kaushik  P,  Chauhan  A  (2008).  In  vitro  antibacterial  activity  of  laboratory  grown  culture  of  Spirulina  platensis.  Ind.  J.  Microbial., 4: 348‐352.  El‐Baky  H,  Baz  K,  Baroty  G  (2008).  Characterization  of  nutraceutical  compounds  in  blue  green  alga  Spirulina  maxima, J. Med. Pl. Res., 2: 292‐300. 

Electronic References    [1] 

http:// www.bioinformatics.org 

[2]  

http:// www.ncbi. lm.nih. gov / PubMed.