membuat sabun padat ekstrak etanol pegagan dan menguji aktivitas antibakteri
... konsentrasi penyari, cara ekstraksi, pelarut, fase gerak cara pengujian sifat.
1
BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Jenis penelitian dilakukan adalah jenis penelitian eksperimental untuk membuat sabun padat ekstrak etanol pegagan dan menguji aktivitas antibakteri sabun padat ekstrak etanol pegagan terhadap S.aureus dan E. coli (Azwar, 2010). B. Variabel Penelitian Variabel yang digunakan dalam penelitian ini antara lain adalah : 1. Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian adalah konsentrasi ekstrak etanol pegagan pada setiap formula sabun padat. 2. Variabel tergantung Yang termasuk dalam variabel tergantung adalah sifat fisik sabun padat dan diameter zona hambat pada uji aktivitas antibakteri pada tiaptiap formula sebagai parameter aktivitas antibakterinya. 3. Variabel terkontrol Variabel terkontrol dalam penelitian ini adalah jenis dari mikroba uji (S. aureus dan E. coli), tempat, cara pengeringan simplisia, jenis dan konsentrasi penyari, cara ekstraksi, pelarut, fase gerak cara pengujian sifat fisik dan aktivitas antibakteri. C. Definisi Variabel Operasional Ekstrak etanol pegagan yang digunakan dalam tiap-tiap formula adalah 1gr; 3gr; dan 6gr. Sedangkan untuk penggunaan basis dari sabun dalam formulasi menggunakan komposisi bahan yang sama yaitu NaOH, aquades, minyak kelapa, minyak zaitun, dan minyak sawit. Perbedaan konsentrasi ekstrak yang digunakan pada masing-masing formula diharapkan dapat menentukan perbedaan diameter zona hambat yang terbentuk pada uji aktivitas antibakteri, sehingga dapat ditentukan konsentrasi yang memiliki aktivitas antibakteri dan sifat fisik sabun yang lebih baik.
2
Uji organoleptis dan uji pH dilakukan untuk menilai konsistensi sabun yang dibuat. Uji organoleptis dilakukan dengan mengamati warna, bentuk, dan bau yang terjadi tiap rentang waktu tertentu selama 4 minggu. Uji pH dilakukan dengan mengukur pH larutan sabun menggunakan stik pH. Uji daya busa terhadap air suling bertujuan untuk mengukur kestabilan sabun dalam membentuk busa. Uji daya busa dilakukan dengan cara mengukur ketinggian busa yang terbentuk dalam gelas ukur. Sedangkan uji kadar air diukur dengan metode destilasi menggunakan toluen untuk mengetahui kadar air yang terkandung dalam masing-masing sabun. Diameter zona hambat pada uji aktivitas antibakteri adalah diameter yang diukur pada daerah bening yang terbentuk disekitar kertas cakram yang telah diisi larutan uji. Daerah bening ini menandakan tidak ada pertumbuhan bakteri sebagai tanda adanya aktivitas antibakteri. D. Alat dan Bahan 1. Alat a. Alat untuk pembuatan simplisia dan ekstraksi Nampan, kain hitam, timbangan analitik, maserator, pengaduk kayu, kain penyaring, cawan porselen, pisau, waterbath. b. Alat untuk pembuatan sabun dan uji sifat fisik Mixer (Philips), cawan porselen, alat-alat gelas (iwaki pyrex), cetakan sabun, Universal Indicator Paper pH (Shxss), destilator, kompor listrik. c. Alat untuk uji aktivitas antibakteri Peralatan yang digunakan adalah alat-alat gelas (Iwaki Pyrex), neraca
analitik
(ACIS),
oven
(Memmert),
kompor
listrik
(Thermoscientic), autoklaf (LD 2X-40S), micropipette (Scoodex), inkubator (Memmert), Vertical Laminar Air Flow (Mascotte), inkubator (Binder). 2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah pegagan yang diambil dari sekitar rumah peneliti (Desa Kaligiri, Kecamatan Sirampog, Kabupaten Brebes),
3
dan etanol 70% (berderajat teknis). Bahan bahan yang digunakan untuk pembuatan sediaan sabun adalah minyak zaitun (Ravika), minyak kelapa (Sania), minyak sawit (Sania), natrium hidroksida (Bratachem), dan aquades. Bahan-bahan yang digunakan dalam pengujian aktivitas antibakteri sabun padat ekstrak etanol pegagan adalah: Nutrien Agar (Merck), Nutrient Broth (Oxoid), aquades, sabun padat merk ‘X’, dan kertas cakram. Bakteri uji yang digunakan adalah S. aureus dan E. coli yang diperoleh dari Laboratorium Biologi Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas Muhammadiyah Purwokerto. E. Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Determinasi tanaman pegagan (Centella asiatica) dilakukan dengan mencari beberapa sumber informasi dari penelitian-penelitian yang terkait dengan pegagan untuk dicocokan dengan tanaman yang digunakan. Tujuan dari determinasi ini adalah untuk memastikan tanaman yang digunakan dalam penelitian merupakan tanaman yang dimaksud yaitu tanaman Centella asiatica. 2. Pengumpulan Tanaman dan Pembuatan Simplisia Tanaman Pegagan diperoleh dari Desa Kaligiri, Kecamatan Sirampog, Kabupaten Brebes. Tanaman yang diperoleh di bersihkan dari kotoran dengan air mengalir, kemudian ditiriskan sampai permukaan tanaman kering. Bagian tanaman yang digunakan adalah seluruh bagian tanaman kecuali akar. Kemudian dikeringkan dibawah sinar matahari dengan ditutup kain hitam. Setelah kering, simplisia yang didapat di serbukan dengan bantuan blender. 3. Pembuatan ekstrak etanol pegagan Serbuk yang diperoleh lalu diekstraksi dengan metode maserasi dengan alat maserator dan pelarut etanol teknis 70%. Sebanyak 300 gram serbuk simplisia pegagan dimasukkan ke dalam maserator, lalu ditambah dengan penyari etanol 70% sebanyak 3000 ml dan diaduk sesekali selama 6 jam. Kemudian didiamkan selama 18 jam. Pisahkan maserat dan ulangi
4
maserasi sebanyak 2 kali dengan pelarut dan jumlah yang sama. Maserat kemudian diuapkan dalam cawan porselen diatas penangas air untuk memperoleh ekstrak kental (BPOM, 2004). Kemudian dihitung rendemen ekstrak terhadap serbuk simplisia pegagan. 4. Pembuatan sabun mandi padat ekstrak etanol pegagan a. Formulasi Formulasi
sediaan
sabun
padat
ekstrak
etanol
pegagan
menggunakan basis sabun yang terdiri dari minyak zaitun, minyak kelapa, minyak kelapa sawit dan NaOH dalam air. Komposisi tiap formulasi dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1 Formulasi sabun mandi padat Bahan
KN
FI
F II
FIII
Minyak kelapa
20 gr
20 gr
20 gr
20 gr
Minyak zaitun
15 gr
15 gr
15 gr
15 gr
Minyak sawit
10 gr
10 gr
10 gr
10 gr
NaOH
7,3 gr
7,3 gr
7,3 gr
7,3 gr
Ekstrak pegagan
-
1 gr
3 gr
6 gr
Aquades
15 mL
15 mL
15 mL
15 mL
Keterangan: KN : Kontrol negatif F II : Formulasi II
F I : Formulasi I FIII : Formula III
NaOH yang dibutuhkan dalam formulasi dihitung setelah jumlah minyak ditentukan. Banyaknya NaOH yang dipakai merupakan jumlah total hasil perhitungan dari nilai saponifikasi untuk ketiga jenis minyak yang digunakan. b. Cara pembuatan sabun padat NaOH ditimbang sesuai pada formulasi, dan dilarutkan dalam aquadest (NaOH dituangkan ke dalam air), kemudian diaduk sampai larut seluruhnya. Minyak kelapa, minyak zaitun, dan minyak sawit yang sudah ditimbang sesuai formulasi dimasukkan dalam mixer, dan ditambahkan dengan larutan NaOH. Kemudian diaduk dengan mixer sampai homogen dan terjadi trace (kondisi dimana sabun sudah terbentuk dengan tanda massa sabun mengental). Ekstrak pegagan ditambahkan pada saat trace tersebut, dan diaduk kembali hingga
5
homogen. Massa sabun yang masih berbentuk cair dituang ke dalam cetakan dan ditunggu sampai mengeras. 5. Evaluasi sifat fisik sabun padat a. Uji organoleptik Uji ini dilakukan dengan cara dilihat dari bentuk, warna, dan bau dari sabun padat ekstrak etanol pegagan pada penyimpanan selama 4 minggu. b. Uji pH Sejumlah sabun dilarutkan dalam air sampai larut. pH diukur pada sabun untuk masing-masing formula, dengan menggunakan Universal Indicator Paper pH. Pengamatan nilai pH dilakukan selama 4 minggu untuk mengetahui perubahan nilai pH sabun padat. c. Uji daya busa Uji daya busa terhadap air suling dilakukan dengan cara yaitu larutan sabun 1 % sebanyak 50 ml dimasukkan ke dalam gelas ukur 1L kemudian tingginya diukur. Teteskan 200 ml larutan yang sama dengan bantuan buret dengan ketinggian 90 cm di atas permukaan sabun, pada menit 0, 0,5, 3, 5, dan 7 tinggi busa yang terbentuk diukur (Kurniawati, 2004). d. Uji kadar air Uji kadar air dilakukan dengan cara destilasi menggunakan toluen. Cara yang digunakan adalah dengan membersihkan tabung penerima (labu alas bulat) dengan air, kemudian dikeringkan dalam lemari pengering untuk menghilangkan sisa air yang mungkin masih tertinggal. Sejumlah sabun dimasukkan ke dalam labu kering yang ditimbang seksama yang diperkirakan mengandung 2 ml sampai 4 ml air. Kurang lebih 200 ml toluen dimasukkan ke dalam labu lalu hubungkan alat. Toluen dituangkan ke dalam tabung penerima. Kemudian dipanaskan dengan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mulai mendidih penyulingan dilakukan dengan kecepatan kurang lebih 2 tetes tiap detik, hingga sebagian air tersuling, kemudian kecepatan
6
penyulingan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dicuci dengan toluen, sambil dibersihkan dengan sikat tabung yang disambungkan pada sebuah kawat tembaga dan
lebih dulu dibasahi dengan toluen, dilanjutkan
hingga 5 menit. Tabung penerima dibiarkan mendingin hingga suhu kamar. Jika ada tetes air yang melekat pada pendingin tabung penerima, air tersebut digosok dengan karet yang diikatkan pada sebuah kawat tembaga dan basahi dengan toluen hingga tetesan air turun. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dan kadar air dihitung dalam persen (DEPKES RI, 2000). 6. Kromatografi Lapis Tipis Uji kromatografi lapis tipis bertujuan untuk mendeteksi ekstrak etanol pegagan dalam sediaan sabun padat. Fase gerak yang digunakan adalah butanol : asam asetat glasial : air (6:3:1). Fase gerak yang telah dibuat dimasukan kedalam bejana KLT dan dijenuhkan. Ekstrak, FI, FII, dan FIII disiapkan dengan cara membuat larutan 1% dalam etanol 70% dari masing-masing sampel. Larutan kemudian di totolkan pada lempeng Silika G F254. Lempeng silika dimasukkan kedalam bejana berisi fase gerak yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan cara ditutup dengan kaca. Elusi dilakukan sampai tanda batas elusi. Kemudian dikeluarkan, dianginanginkan
dan hasilnya diidentifikasi. Identifikasi diamati pada sinar
tampak, UV 254 dan UV 366. Selanjutnya dilakukan perhitungan nilai Rf dari masing-masing bercak. Pereaksi semprot 5% H2SO4 dalam etanol digunakan untuk memperjelas spot. 7. Evaluasi aktivitas antibakteri a. Sterilisasi alat Alat-alat yang disterilkan antara lain adalah gelas piala, tabung reaksi, erlenmeyer, cawan petri, dan spatula. Alat-alat disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121o C selama 30 menit dengan tekanannya diatur sebesar 15 dyne/cm3 (1 atm). Alat-alat yang akan disterilkan dicuci bersih dengan air mengalir terlebih dahulu, kemudian
7
dikeringkan dan dibungkus dengan kertas perkamen (Dwidjoseputro, 1998). b. Pembuatan medium Medium yang digunakan adalah Nutrient Agar dan Nutrient Broth. Medium agar dibuat dengan mencairkan nutrient agar dalam penangas air pada suhu ±50o C. Kemudian medium agar dituangkan ke dalam cawan petri yang sudah disterilkan sebelumnya, lalu disterilkan pada autoklaf pada suhu 121o C dan tekanan 1 atm selama 30 menit. Nutrien Broth dibuat dengan melarutkan nutrient broth dalam aquades kemudian dipanaskan pada suhu ±50o C. Kemudian medium Nutrien broth
dituangkan
kedalam
erlenmeyer
yang
telah
disterilkan
sebelumnya, lalu disterikan kembali dengan autoklaf pada suhu 121o C dan tekanan 1 atm selama 30 menit (Sri Suhartini, 2011). c. Peremajaan biakan murni Untuk meremajakan biakan bakteri yang telah dibuat dengan cara memindahkan bibit dari koloni bakteri yang lama ke medium yang baru. Kemudian diinkubasikan selama 18-24 jam sebelum digunakan untuk uji (Dwidjoseputro, 1998). d. Uji aktivitas antibakteri (metode difusi agar) Bakteri uji diinokulasikan dalam media nutrien broth dan diinkubasikan selama 18-24 jam. Kemudian suspensi bakteri diukur serapannya pada spektrofotomerti dengan panjang gelombang 625 nm hingga didapatkan serapan ± 0,1. Turbiditas suspensi bakteri yang mempunyai serapan ± 0,1 pada panjang gelombang 625nm mempunyai jumlah bakteri 1-2 x 108 CFU/ml setara dengan standar 0,5 Mc Farland (Lalitha, 2004). Media nutrient
agar
yang digunakan dibuat
dengan cara
menuangkan ±15 mL medium nutrient agar yang sudah dicairkan terlebih dahulu ke dalam cawan petri. Kemudian ditambahkan 1 mL suspensi
bakteri dari
biakan,
campuran
suspensi
dan
media
dihomogenkan dengan digoyang membentuk arah angka delapan. Lalu
8
didiamkan supaya mengeras, setelah mengeras media ini digunakan untuk uji antibakteri. Metode yang digunakan adalah metode difusi agar dengan menggunakan kertas cakram (paper disc). Kertas cakram diletakan pada media agar yang berisi biakan bakteri kemudian diisi larutan uji dengan meneteskan 10µL masing-masing larutan kelompok perlakuan dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Diameter zona hambat yang ditimbulkan diukur dengan jangka sorong, zona hambat ditandai dengan adanya daerah bening disekitar kertas cakram. Tabel 2 Perlakuan Uji Aktivitas Antibakteri No.
Perlakuan
Keterangan
1
Kelompok satu
Formula I sabun mandi padat 10% dalam aquades.
2
Kelompok dua
Formula II sabun mandi padat 10% dalam aquades.
3
Kelompok tiga
Formula III sabun mandi padat 10% dalam aquadest.
4
Kelompok empat
Kontrol negatif sabun mandi padat 10% dalam aquades.
5
Kelompok lima
Kontrol ekstrak etanol pegagan 10% dalam aquades.
6
Kelompok enam
Kontro positif sabun antibakteri merk ‘X’ 1% dalam aquades
F. Analisis Hasil Hasil uji kadar air dan uji aktivitas antibakteri sabun mandi padat, dilakukan analisis statistik ANOVA satu arah dengan taraf kepercayaan 95%. Sedangkan untuk hasil uji tinggi busa akan dilakukan analisis ANOVA dua arah. Hasil dari uji kadar air dan nilai pH sabun mandi padat dilakukan analisis secara deskriptif, yaitu dengan membandingkannya dengan standar yang sudah ditetapkan oleh Badan Standarisasi Nasional. *. The mean difference is significant at the 0.05 level.
