Bioequivalence and safety study of letrozole tablet in healthy Chinese ...

7 downloads 26234 Views 678KB Size Report
Email: [email protected]; [email protected] ... marketing of this newly developed generic formulation in China. 2. Materials and methods. 2.1. Clinical ...
190 

Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences 

http://www.jcps.ac.cn 

Bioequivalence and safety study of letrozole tablet in healthy Chinese  postmenopausal women volunteers  Yi Liu 1 , Yifan Zhang 2 , Qian Wang 1 , Wei Yang 1 , Xiaoyan Chen 2 , Shan Jing 1 , Libo Zhao 1 ,  Chunyan Zhang 1 , Lihui Wei 3 , Xiaoping Li 3 , Wanyu Feng 1 , Dafang Zhong 2* , Yi Fang 1*  1. Department of Pharmacy, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China  2. Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China  3. Department of Gynecology and Obstetrics, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China 

Abstract: Letrozole is an orally active aromatase inhibitor for the treatment of postmenopausal women with breast cancer.  A single­dose, randomized, open­label, two­way crossover study was designed to compare the bioequivalence and safety of  two formulations of letrozole (2.5 mg/tablet), including a newly developed generic formulation (test) and a branded formulation  (reference) in a group of healthy Chinese postmenopausal women volunteers under fasting conditions. Blood samples were obtained  before study drug administration and at 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50, 2.00, 2.50, 3.00, 3.50, 4.00, 6.00, 8.00, 12.00, 24.00,  48.00, 72.00, 96.00, 144.00, 192.00 and 240.00 h after drug administration. Letrozole levels in plasma were analyzed using  a  liquid  chromatography­tandem mass spectrometry (LC­MS/MS) method. The safety profile was evaluated by adverse events  (AEs) record, and assessed by physical examination, vital signs, spontaneous reporting, and clinical laboratory results. A total of  30 healthy Chinese postmenopausal women were enrolled in this study; however, only 29 subjects were included in bioequivalence  assessments due to serious adverse events (SAEs) in 1 subject. The 90% CIs for the ln­transformed ratios of Cmax, AUC0–t, and  AUC0–∞ were 99.55%–115.17%, 97.35%–103.50%, and 97.29%–103.96%, respectively. All values met the predetermined criteria  for  assuming  bioequivalence.  One  subject  (3.3%)  experienced  SAE  who  received  the  reference  formulation  and  10  subjects  (33.3%) reported a total of 13 mild AEs (4 reported from 4 subjects who received the test formulation, and 9 reported from  6 subjects who received the reference formulation). In this single­dose (2.5 mg) study, we found that the test and reference  formulations  of  letrozole  tablet  met the  regulatory  definition  for assuming  bioequivalence  in  healthy  Chinese  postmenopausal  women. Both formulations were generally well tolerated in the population studied. Chinese Clinical Trials registration number:  ChiCTR­TRC­11001457.  Keywords: Letrozole; Bioequivalence; Safety; LC­MS/MS; Chinese postmenopausal women  CLC number: R945.1 

Document code: A 

1. Introduction  Letrozole, systematically named 4,4'­[1H­1,2,4­triazol­  1­yl­methylene]  bis­benzonitrile  (CAS  112809­51­5),  is  a  third  generation,  competitive  and  highly  specific  non­steroidal  inhibitor  of  the  aromatase  enzyme  system,  which could block the conversion of androgens to estrogens  in all tissues [1] . Suppression of estrogen synthesis by inhi­  bition of the aromatase enzyme system has been regarded  as a  crucial  point in the  treatment  of  estrogen­dependent  breast  cancers.  Letrozole  has  been  indicated  for  the  hormonal treatment of advanced breast cancer in women  with natural or artificially induced postmenopausal status,  who  have  disease  progression  following  antiestrogen  therapy.  Letrozole has been  demonstrated to be associated  with  greater  estrogen  suppression  effect  compared  with  other aromatase inhibitors, such as anastrozole, exemestane,  formestane, and aminoglutethimide [2,3] .  Letrozole  is  rapidly  and  completely  absorbed  from  Received date: 2012­12­17.  *  Corresponding author. Tel.: 86­21­50800738; 86­10­66583834;  E­mail: [email protected]; [email protected]  doi:10.5246/jcps.2013.02.027 

Article ID: 1003–1057(2013)2–190–07 

the gastrointestinal tract (mean absolute bioavailability is  99.9%) [4] .  Food  slightly  decreases  the  rate  of  absorption  (median  Tmax: 1  h  fasted  versus  2  h  fed; and  mean Cmax:  (129±20.3) nmol/L fasted versus (98.7±18.6) nmol/L fed),  but the extent of absorption (AUC) is not changed. Plasma  protein  binding  of  letrozole  is  approximately  60%.  The  concentration of letrozole in erythrocytes is about 80%  of that in plasma. The apparent volume  of distribution at  steady state is about (1.87±0.47) L/kg. Metabolic clearance  to a pharmacologically inactive carbinol metabolite is the  major  elimination  pathway  of  letrozole  (CLm  =  2.1  L/h),  which is  relatively  slow  compared  to  hepatic  blood  flow  (about 90 L/h).  Although  the  pharmacokinetics  (PK)  or  bioavailability  of  letrozole  has  been  previously  examined  in  different  populations [4–8] ,  including  Chinese  healthy  men [9–11] ,  no  data are available in healthy Chinese postmenopausal women  subjects. The present study was designed to investigate the  bioequivalence  and  safety  properties of two  formulations  of  letrozole  2.5  mg  tablet,  including  a  newly  developed  generic   formulation   (test)   and   a   branded   formulation  (reference)  in  healthy  Chinese  postmenopausal  women  population. We established a validated LC­MS/MS method

Y. Liu et al. / Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences 22 (2013) 190–196 

for the  determination and  quantification  of  letrozole in  human   plasma.   Our  study  was   necessary  before  the  marketing of this newly developed generic formulation  in China. 

2. Materials and methods  2.1. Clinical protocols  The  present  study  was  conducted  in  accordance  with  the ethical standards for studies in humans of the Declara­  tion  of Helsinki and  its amendments [12] , the International  Conference on Harmonisation Guideline for Good Clinical  Practice [13] , and  the  Guideline for Good Clinical Principles  recommended by the SFDA of China [14] . The study protocol,  informed­consent  form, and consent methods were approved  by  the  Ethics  Committee  of  Peking  University  People’s  Hospital  prior  to  subject  screening  and  enrollment.  The  bioequivalence  study  in  clinical  trials  was  conducted  at  the  laboratory  of  Peking  University  People’s  Hospital,  which was accredited by the National Center for Clinical  Laboratories of China.  2.2. Formulations and subjects selection  This   study  evaluated   a   test   formulation   (Trozet ® ,  Fresenius  Kabi  Oncology  Ltd.,  Beijing,  China;  Lot  No.  871AH00203; Expiration date, Mar. 2013) and a reference  formulation   (Femara ® ,   Novartis   Pharma   Stein   AG,  Switzerland;  Lot  No.  SO803;  Expiration  date,  Feb.  29 th ,  2016) of lerozole at a dose of 2.5 mg/tablet.  Healthy  Chinese   postmenopausal   women   volunteers  participated in this study were enrolled in Phase I Clinical  Trial  Unit  of  Peking  University  People’s  Hospital  from  Dec. 2011 to Apr. 2012. Healthy Chinese postmenopausal  women aged older than 40 years old, with BMI between 18  and 25 kg/m 2 , weight at least 50 kg, not having experienced  menstruation  for  at  least  one  year,  and  having  plasma  follicle­stimulating hormone (FSH) and estradiol levels  in the postmenopausal  range were  eligible  for  this  study.  All  subjects  were  assessed  by  medical  history,  physical  examination,  vital  signs  (body  temperature,  sitting  blood  pressure,  pulse,  and  respiration  rate),  laboratory  analysis  (hematology,  blood  biochemistry,  urinalysis,  and  hepatic  function), 12­lead ECG and chest radiography.  Subjects were excluded from the study with any  of the  reasons, including unable to provide consent; had abnormal  findings  on ECG or  measurement of  vital signs; had  any  clinically  significant  abnormality  based  on  medical  and  laboratory  analysis;  had  positive  results  for  hepatitis  B,  hepatitis   C,  syphilis   or  HIV   on  laboratory  testing  at  screening;  smoked;  had  a  history  of  drug  addiction  or  significant use of alcohol (defined as a history  of alcoholism  or  moderate  alcohol  use);  had  consumed  alcohol  within  48 h before administration of the medicine; had a history  of  any  allergic  reactions;  or  had  used  drugs  known  to  affect hepatic drug metabolism within 14 d before admini­  stration  of  study  medication.  Subjects  were  required  to 

191 

verify  the  absence  of  significant  use  of  drugs  or  alcohol  by  both  drug  scanning  and  breath  alcohol  test  before  check­in. Subjects were also excluded if they had a history  of  any disease  or  condition  that  might  compromise  body  systems   (renal,   hepatic,   endocrine,   pulmonary,   central  nervous,  cardiovascular,  immunological,  dermatological,  gastrointestinal  or  any  other  body  system).  Additional  exclusion  criteria  included  a  history  of  asthma,  known  hypersensitivity  or  idiosyncratic  reaction  to  letrozole  or  any related drugs.  Subjects were instructed to abstain from using any medi­  cations  for  ≥14  d  prior  to  and  during  the  study.  The  subjects  had  been  informed  about  the  details,  including  the  risks and benefits  of  this  study,  and  provided  written  informed  consent  before  participating  in  the  study.  All  subjects were free to withdraw from the study at any time.  2.3. Study procedure  This  was  a  randomized­sequence,  single­dose,  open­label,  two­period   crossover   bioequivalence   study.   Based   on  published  data,  the  intra­subject  coefficients  of  variation  should be approximately 14% for AUC and 16% for Cmax  individually [7] . Based on these data, as well as an expected  Test/Reference  ratio  of  AUC  and  Cmax  within  0.90  and  1.10,  the  study was  expected  to have  a  power  of  at  least  80% to show bioequivalence with 28 subjects. Considering  of  possible  dropout  and  withdrawn  during  the  study,  we  decided  to  include  30  subjects  to  ensure  the  test  power.  The  order  of administration of two formulations  for each  subject during the 2 study periods was determined according  to a randomization schedule on the basis of body weight.  Equal allocation of subjects to each sequence was ensured.  The study personnel involved in the sample analysis were  blinded  from  the  randomization  code  during  the  entire  study. Treatment phases were separated by a minimum  21­day washout period, which was 5 to 7 times of the t1/2  of letrozole (~2 d).  The  subjects were confined  to  the  hospital 11  h  before  drug  administration  and  for  96  h  after  administration.  Therefore,  every  subject  had  to  stay  for  5  consecutive  nights in Phase I Clinical Trial Unit of Peking University  People’s  Hospital  in  each  treatment  period,  and  had  to  visit the  trial  facility at  the 144  h  (d  7),  192  h  (d  9)  and  240 h (d 11) after drug administration in each period.  After  an  overnight  fast  for  10  h,  the  subjects  received  the drug in either formulation in sitting posture, taken with  (240±2)  mL  of  water.  This  activity  was  followed  by  a  mouth check to assess administration compliance. Subjects  were instructed to remain in a sitting or ambulatory posi­  tion  for  the  first  3  h  after  administration.  Thereafter  subjects were allowed to engage in normal activities only,  but  were  required  to  avoid  any  severe  physical  exertion.  Water intake was permitted 2 h after treatment, and food  intake was allowed 4 h after treatment. Alcoholic beverages,  intense  physical  activity,  and  smoking  were  not  allowed  during  the  study.  The  standardized  lunch  and  dinner  (8 kcal/kg body weight; 55% carbohydrate, 15% protein,  and 30% fat) were provided 4 h and 10 h after administration

192 

Y. Liu et al. / Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences 22 (2013) 190–196 

during  their  staying  in wards,  respectively.  During  study  period out off the wards (about 41  d out  of  ward between  the  screening  period,   wash­out  period,  Period  I  and  Period  II),  subjects  need  to  keep  delicate  balance  diet.  Any diet that may cause allergy  and  high­fat  diet should  be prohibited.  For  the  measurement  of  letrozole  concentrations  in  the plasma, blood samples (3 mL) were collected from  a  suitable  forearm  vein  into  vacuum  heparinized  tubes.  Samples  were  obtained  before  study  drug  administration  (baseline)  and  at  0.25,  0.50,  0.75, 1.00,  1.25,  1.50,  2.00,  2.50,  3.00,  3.50,  4.00,  6.00,  8.00,  12.00,  24.00,  48.00,  72.00,  96.00,  144.00,  192.00  and  240.00  h  after  drug  administration. Blood samples after 96.00 h were collected  on  an  ambulatory  basis.  Before  each  blood  sample  was  collected,  heparin  in  the  heparin­locked  catheter  was  discarded with 0.5 mL of blood, and 3 mL of blood was  collected  into  a  vacuum  tube.  Plasma  was  immediately  separated by centrifugation at 2000 g for 10 min below  10 °C, and was kept in ice­water bath before  and  during  separation.  The  separated  plasma  was  then  transferred  to  pre­labeled  polypropylene  tubes  in  2  aliquots  [around  0.4 mL in first lot (0.8  mL  for the pre­dose sample)  and  the  remaining  blood  in  second  lot]  and  stored  at  –80  °C  until LC­MS/MS analysis. After administration of the other  formulation,  blood  samples  were  drawn  and  analyzed  in  the exact same manner.  2.4. Drug analysis  In this study, a simple and validated method was used for  the determination of letrozole in plasma by an LC­MS/MS  method. Letrozole (purity, 99.9%, Batch No. 1204­100A1)  and  d4­Letrozole  (internal  standard,  IS,  purity,  99.8%,  Batch No. 1040­005A1) were purchased from TLC Phar­  machem., Inc. (Ontario, Canada).  HPLC­grade acetonitrile  and  methanol  were  supplied  by  Sigma  (St.  Louis,  MO,  USA). Ammonium acetate (HPLC­grade) was  purchased  from Fluka Company (Germany).  The  LC  system  (Agilent  1100,  Waldbronn,  Germany)  was equipped with a quaternary pump (G1311A), a vacuum  degasser (G1322A), a thermo stated column oven (G1316A),  and an autosampler (G1367A). Chromatographic separation  was  achieved  with  a  100  mm×4.6  mm,  5.0  μm  Capcell  PAK­C18  column  (Shiseido  Co.,   Ltd.,   Tokyo,   Japan)  protected  with  a  3.0  mm×4.0  mm,  5.0  μm  C18  catridge  guard (Phenomenex Inc., Torrance, California, USA). The  mobile phase was composed of a mixture of methanol and  10.0 mM ammonium acetate (65:35, v/v) at a flow rate of  0.6 mL/min.  MS detection  was  performed using a  Thermo  Electron  Finnigan TSQ Quantum Ultra triple quadrupole instrument  (San Jose, CA, USA) operated in negative ionization mode.  The  ionspray  voltage  was  set  at  3500  V  and  the  source  temperature was maintained at 320 °C. Nitrogen was used  as the sheath gas  (35 Arb)  and auxiliary  gas  (10  Arb)  to  assist with nebulization and dissolution. For collision­induced  dissociation (CID), argon was used as the collision gas at  a pressure of 1.2 mTorr. The optimized collision energies 

(CEs)  for  transitions  of  letrozole  and  IS  were  both  set  at 25 eV.  Quantification  was  performed  using  multiple  reaction  monitoring (MRM) of the transitions of m/z 284→(215+242)  for letrozole and m/z 288→(219+246) for IS, respectively,  with a scan  time  of  0.2  s per  transition. Data acquisition  and processing were powered by the Agilent ChemStation  and Finnigan Xcalibur software 2.0.7 packages.  Sample  preparation  involves  a  simple  one­step  protein  precipitation  without  the  requirement  of  an  evaporation  step. Briefly, frozen plasma samples from the subjects were  thawed  to  room  temperature.  After  vortexing,  a  12.5  μL  aliquot of the IS solution, 25 μL methanol–water (1:1, v/v)  and 200 μL acetonitrile were added to 100 μL  of plasma  sample.  The  mixture  was  vigorously  vortexed  for  1  min  and  centrifuged  at  11  000  g  for  5  min.  Finally,  20  μL  supernatant  was  injected  into  the  LC–MS/MS  system  for analysis.  2.5. Tolerability assessments  Two physicians were available within the clinical facility  when the subjects were housed (from check­in to check­out)  and  during  ambulatory  blood  sampling  in  each  period.  Subjects  might  contact  with  investigators  at  any  time  during  the  study  period.  Tolerability  of  the  drug  in  two  formulations  was  determined  by  monitoring  vital  signs  (body  temperature,  sitting  blood  pressure,  pulse,  and  respiration  rate)  at  baseline  (before  dosing),  at  approxi­  mately  2,  6,  12  h  after  administration,  and  at  completion  of  the  study.  Physical  examinations  were  performed  at  baseline  and  at  completion  of  the  study.  Laboratory  tests  including hematology, blood  biochemistry  and  urinalysis  and  12­lead  ECGs  were  also  performed  at  baseline,  approximately  24  h  after  administration  and  completion  of the study. Health status of subjects was asked at the time  of  clinical examination and during ambulatory samplings  in each period.  AEs were assessed at the time of each blood draw using  direct observation, spontaneous reporting, and nonspecific  questioning.  Any  undesirable  sign,  symptom,  or  medical  conditions   occurring  after  the  study  were  recorded  regardless of the suspected relationship to the study drug.  AEs  were graded  as  mild,  moderate,  or  severe,  and  their  relationship  to  the  study  drug  was  determined  by  the  physicians as not related, probably not related, uncertain,  possibly  related,  probably  related,  or  definitely  related.  Important  medical  events  that  may  result  in  death,  life  threatening,  requiring  hospitalization,  leading  to  disability,  or  requiring  medical  intervention  to  prevent  permanent  impairment or  damage  may  be  considered as  SAEs  drug  experience  based  on  appropriate  medical  judgment.  All  AEs  and  SAEs  were  recorded  in  the  source  data  and  case­report form, and their relationship to the study drug  was determined by the study physicians who were blinded  to the randomization schedule.  2.6. Pharmacokinetic and statistical analysis  PK  analysis  was  conducted  with  a  non­compartmental

Y. Liu et al. / Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences 22 (2013) 190–196 

193 

method using Phoenix  WinNonlin version 6.1  (Pharsight  Corporation,  Mountain  View,  California).  Cmax  and  Tmax  were obtained directly from the concentration­time curves  of letrozole. PK properties were analyzed by noncompart­  mental  PK  data  analysis  based  on  an  equation  described  by  Shumakerusing  PKCALC,  a  widely­used  computer  program  for   PK   analysis [15] .  AUC0−t  was   calculated  according  to  the  linear  trapezoidal  rule.  AUC0–∞  was  calculated  as  AUC0−t  +  C t/λz ,  where  C t  was  the  final  concentration and λz  was the slope  of  the  linear regression  of the ln­transformed concentration­time curve. The t1/2 of  letrozole in plasma was calculated as 0.693/λz [16] .  Descriptive  statistics,  including  mean  and  SD,  were  used  to  summarize  the  PK  data  for  two  formulations.  ANOVA   was   performed   on   the  ln­transformed  PK  parameters  (AUC0−t,  AUC0–∞,  and  Cmax).  The  model  of  ANOVA  had  fixed  factors  for  sequence,  treatment,  and  period and subject within sequence. The Wilcoxon signed  rank  test  was  used  for  the  nonparametric  analysis  to  determine  differences  in  Tmax.  As  proposed  by  FDA,  if  the parametric 90% CI fell within a predetermined  range  of 80% to 125%, the two formulations were considered  to meet the regulatory criteria for bioequivalence. 

of  quantitation  (LLOQ) of this assay  was  0.4 ng/mL  and  the intra­ and inter­day precisions were 5.0% and 12.9%,  with  relative  error  to  be  7.4%.  The  intra­  and  inter­day  precision values for  QC samples  were  3.4%–5.5% and  1.6%–8.9%,  respectively,  with  relative  errors  from  –0.9%  to 4.4%. The mean extraction recoveries were 70.7%–76.3%,  and 79.6% for letrozole and IS, respectively.  The analyte  and IS were stable in an auto sampler at room temperature  for  ≥6  h,  after  pre­extraction  at  room  temperature  for  24  h,  after  three  freeze­thaw  cycles  and  after  116  d  of  storage  at  –20  °C  and  –80  °C,  with  relative  standard  deviations  (RSDs)  of  1.1%–1.8%,  2.4%–6.1%,  2.2%–4.1%,  2.8%–5.0% and 2.4%–2.5%, respectively.  The accuracy and  precision for dilution samples at 150 ng/mL were –3.5% and  2.0%, respectively. Dilution samples were diluted 5­fold  with blank plasma before sample analysis. Taken together,  these results indicate that the established LC­MS/MS method  was simple, sensitive, accurate, and rapid, which could be  used  in  bioequivalence  study  according  to  international  guidelines [18,19] . The QC samples and the calibration curves  were  analyzed  with  processed  test  samples  at  intervals  in  each  run.  The  results  of  the  QC  samples  provided  the  basis for accepting or rejecting the run. 

3. Results 

3.2. Pharmacokinetic properties 

3.1. Drug analysis 

A  total  of  30  healthy  Chinese  postmenopausal  women  volunteers   were  enrolled  in  this  study.   One  subject  withdrew  from  the  study  because  of  SAE.  Therefore,  29  subjects  were  included  in the  PK  and  bioequivalence  analyses. All 30 subjects were included in the tolerability  assessment.  Demographic  characteristics  of  the  subjects  were summarized in Table 1.  The  mean  letrozole  plasma  concentration­time  curves  after oral administration of single 2.5 mg tablet of formu­  lations  in  29  healthy  Chinese  postmenopausal  women  volunteers are shown in Figure 1. The primary PK parameters  of letrozole are listed in Table 2. 

Table 1. Baseline demographic characteristics (Mean, SD)  Safety study (n = 29) 

Age (years) 

54.8 (4.7) 

54.9 (4.7) 

Weight (kg) 

56.6 (4.6) 

56.4 (4.6) 

Height (cm) 

158.9 (4.9) 

158.7 (4.8) 

BMI (kg/m 2 ) 

22.4 (1.3) 

22.4 (1.4) 

Table 2. Comparison of PK parameter of letrozole  Parameter 

Test (Mean, SD) 

Reference (Mean, SD) 

Cmax  (ng/mL) 

47.2 (11.0) 

44.8 (13.6) 

Tmax  (h) 

1.49 (0.72) 

1.66 (0.97) 

AUC0–t  (ng∙h /mL) 

1840 (602) 

1820 (596) 

AUC0–∞  (ng∙h /mL) 

2060 (820) 

2040 (815) 

t1/2z  (h) 

63.3 (25.2) 

62.0 (25.8) 

CL/F (L/h) 

1.43 (0.62) 

1.43 (0.58) 

60 Plasma letrozole concentration (ng/mL) 

Bioequivalence study (n = 30) 

50 40 30 20

60 Plasma letrozole concentration  (ng/mL) 

The  analytical  method  during  validation  process  has  been demonstrated to be suitable for the determination of  letrozole in human plasma for bioequivalence study. This  process  in  our  study  conformed  strictly  to  the  FDA  guidance for the validation of bioanalytical methods [17] .  Under the above conditions, the calibration curves were  linear over the range of letrozole concentrations from 0.4 to  50 ng/mL in human plasma with a coefficient of correlation  (r 2 ) at 0.9990. No peaks interfering with quantitation were  observed throughout the validation process. The lower limit 

Test  Reference

50 40 30 20 10  0  0 

1           2           3  t (h) 

4           5 



10  0  0             40             80            120          160           200          240  t (h) 

Figure   1.  Meanplasma   concentration­time  curves  of  letrozole  following a single 2.5 mg oral dose of a test or reference formulation  (n = 29). The LLOQ was 0.4 ng/mL. 

194 

Y. Liu et al. / Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences 22 (2013) 190–196 

3.3. Bioequivalence evaluation  ANOVA  was performed  on  the ln­transformed  data  of  Cmax,  AUC0–t  and  AUC0–∞.  On  ANOVA,  no  sequence  or  formulation effects were observed  for any PK properties.  However,  a  significant  period  effect  was  observed  for  Cmax  (P