Case report

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Servizio di Medicina Trasfusionale, Azienda Ospedaliera "SS Antonio e Biagio e C. Arrigo", ... knowledge, which is the natural complement of manual.
Case report Weak ABO variants. Old serology stands the test of time. Considerations from a case report Daniela Inverardi, Adriana Perna, Lucia Rossi, Piero Borzini Servizio di Medicina Trasfusionale, Azienda Ospedaliera "SS Antonio e Biagio e C. Arrigo", Alessandria, Italy

"Über Agglutinationserscheinungen normalen menschlichen Blutes" is the title of the original work in which the young assistant, Karl Landsteiner, described the curious crossed agglutination picture seen when his own serum and red cells were mixed with those of his colleagues who worked in the Histopathology Laboratory of the University of Vienna1. Blood groups were still not being mentioned, but the agglutination technique, which would be the basis of all immunohaematology to come, already existed. In modern day immunohaematology the classical test-tube agglutination tests have been largely replaced by methodological developments which, although retaining the general principles of the agglutination reaction, rely heavily on automated technology adapted for large-scale immunohaematological testing. Furthermore, there are now techniques for molecular investigations of DNA which are suitable for genotypic analysis of particular phenotypes2. Just as it should be, there are only a few immunohaematology laboratories that use genome investigative techniques. Nevertheless, these new resources can make the old-guard immunohaematologists feel psychologically inadequate faced with the analytic potentials of the incessant technological progress. On the other hand, the young immunohaematologists, having replaced test-tubes, pipettes and microscopes with microcolumns, plates, dispensers, automatic readers and interfaces with computerised blood transfusion management systems, are losing the dexterity and knowledge, which is the natural complement of manual Received: 2 Februavy 2004 - Accepted: 24 February 2004 Correspondence: Dott.ssa Daniela Inverardi Azienda Ospedaliera "SS Antonio e Biagio e Cesare Arrigo" Via Venezia 18 15100 Alessandria (AL) - Italy E-mail: [email protected]

Blood Transfus 2004; 2: 145-8

"Über Agglutinationserscheinungen normalen menschlichen Blutes" è il titolo del lavoro originale con cui il giovane assistente Karl Landsteiner descriveva il curioso quadro di agglutinazione crociata ottenuta cimentando tra loro i sieri e i globuli rossi di sè stesso e dei suoi colleghi che lavoravano presso il laboratorio di Anatomia Patologica dell'Università di Vienna1. Non si parlava ancora di gruppi sanguigni ma esisteva la tecnica di agglutinazione, che sarebbe stata alla base di tutta l'immunoematologia a venire. Nell'immunoematologia contemporanea la classica agglutinazione in provetta è stata in gran parte sostituita da evoluzioni metodologiche che, pur conservando i principi generali di tale reazione, hanno prodotto una tecnologia robotizzabile adatta alla routine immunoematologica su grande scala. Inoltre, si sono rese disponibili tecniche di indagine molecolare sul DNA adatte all'analisi genotipica di particolari fenotipi2. Come è giusto che sia, i laboratori di immunoematologia che hanno in uso le tecniche di indagine genomica sono pochi. Tuttavia, queste nuove risorse fanno sentire i vecchi immunoematologi di trincea psicologicamente inadeguati di fronte alle potenzialità analitiche dell'incalzante progresso tecnologico. Dall'altra parte, i giovani immunoematologi, avendo sostituito provette, pipette e microscopi con schedine, piastre, dispensatori e lettori automatici e interfacciamenti ai sistemi di gestione informatico della trasfusione, vanno perdendo quella manualità e quella cultura che è il naturale complemento della manualità necessaria a districarsi nelle situazioni immunoematologiche complesse. Qui si descrive l'identificazione di una variante debole di A (Am) effettuata abbinando le tecniche sierologiche classiche ai dispositivi diagnostici in uso per la routine immunoematologica. 145

D Inverardi et al. Table I - Blood group determination. First step Direct test (monoclonal antisera) Indirect test 22 °C

A ±* A1 -

B A2 -

AB ±* B +++

Table II - Blood group determination. Second step Rh-D ++++ O -

* very weakly positive, lack of obvious double population

Direct test (polyclonal antisera cards) (liquid phase monoclonal antisera) Indirect test 4 °C

A ±* ±§ A1 -

B A2 -

AB ±* ±§ B +++

Rh-D ++++ ++++ O -

* very weakly positive, lack of obvious double population § very weak microscopic positivity (~ 5% of agglutinated cells), lack of mixed field

skills, necessary to disentangle complex immunohaematological situations. Here we describe the identification of a weak A variant (Am) achieved through the combined use of classical serological techniques and diagnostic devices in routine immunohaematological practice.

Case report Blood grouping was carried out for a 30-year old woman with no history of previous transfusions on the occasion of her pregnancy reaching term. The proposita, a primigravida, had two reports of blood grouping that had been carried out at two other centres. In one case (1978), her blood group had been defined as O Rh-positive; in the second case (1993) it had been defined as a weak variant of A (probable A3) Rh-positive. We were unaware of these previous results when we carried out the grouping described here. Blood group determinations are carried out in our Centre using column agglutination (DiaMed Italiana, Vedano al Lambro, MI, Italy): a direct test using monoclonal antisera (A-B-A B-D-CDE card), and an indirect test with a NaCl-card and red cell testing (A1-A2-B-O) at room temperature according to the instructions supplied by the kit's manufacturer. The results indicated a weak variant of A (Table I). On the basis of these results, further investigations (2nd step) were planned: for the direct test a Diamed card with polyclonal antisera (A-B-AB-D-D) was coupled with the classical test-tube method using monoclonal antisera (Biotest, Trezzano s/N, MI, Italy). The indirect test was carried out at 4 °C, after autoabsorption to remove any natural anti-I cold autoagglutinins. The results, which confirmed a weak A variant, are presented in Table II. The search for irregular antibodies was carried out on a Liss-Combs card against Diacell I-II-III (DiaMed) test red cells and was negative. The next investigations used to identify the variant are: absorption/elution of anti-A and anti-A B antibodies, a search for substance A1 and substance H on the blood cells, and a search for substances 146

Case report In occasione di una gravidanza a termine è stato eseguito il gruppo sanguigno in una donna di 30 anni con anamnesi trasfusionale negativa. La proposita, primigravida, era in possesso di due precedenti determinazioni di gruppo, effettuate presso due altri enti. In un caso (1978), il gruppo era stato determinato come O Rh-positivo; nel secondo caso (1993) era stato determinato come variante debole di A (probabile A3) Rh-positivo. Questi precedenti non erano a noi noti, al momento della presente determinazione di gruppo. Presso il nostro centro la determinazione dell'emogruppo viene eseguita in agglutinazione su colonna (DiaMed Italiana, Vedano al Lambro, MI): test diretto con l'impiego di antisieri monoclonali (A-B-A B-D-CDE card), test indiretto con NaCl-card ed emazie testo (A1-A2-B-O) a temperatura ambiente, secondo le istruzioni fornite dalla ditta produttrice. I risultati ottenuti corrispondevano ad una variante debole di A (Tabella I). Sulla base di questi risultati sono state approntate ulteriori indagini (2° step) appaiando per il test diretto la card-Diamed con antisieri policlonali (A-B-AB-D-D) e la classica metodica in provetta con antisieri monoclonali (Biotest, Trezzano s/N, MI). Il test indiretto è stato eseguito a 4 °C, previo autoassorbimento per allontanare eventuali autoagglutinine fredde naturali anti-I. I risultati, che confermano una variante debole di A, sono descritti nella tabella II. La ricerca di anticorpi irregolari eseguita, su card LissCombs contro emazie testo Diacell I-II-III (DiaMed) è risultata negativa. Le ulteriori indagini per l'identificazione della variante prevedono: assorbimento/eluizione degli anticorpi anti-A e anti-A B, ricerca della sostanza A1 e della sostanza H sulle emazie, ricerca della sostanza A e H nella saliva (se il paziente è secretore). Anche queste procedure sono state condotte abbinando la metodica sierologica classica3 allo strumentario diagnostico di routine. Per la fase di assorbimento dell'anticorpo anti-A sulle Blood Transfus 2004; 2: 145-8

Am phenotype Table III - Identification of weak variants: absorption/elution and search for group-specific substances Absorption/elution

anti-A monoclonal +++ (NaCl) ++++ (AHG)

anti-A natural ± (NaCl) ++ (AHG)

Search for substance A and H on red blood cells Substance A -

Substance H ++

A and H in the saliva (if the patient is a secretor). These procedures too were carried out combining the classical serological methods3 with now routine diagnostic instruments. Two different sources of antibody were used for the absorption of anti-A antibody on the patient's red cells: a monoclonal anti-A serum (Biotest) diluted 1:2 in physiological saline and an antibody from B group donor with an anti-A titre of 1/128. The eluate was obtained using the reactive Elu-Kit II (Gamma Biologicals, Immucor Italia, Noverasco di Opera, MI, Italy) and was studied on a NaClcard and a Coombs-card (DiaMed), using both commercial test A1 and O red cells (DiaMed) as well as A and O red cells obtained from a pool of donors. The search for substance A1 and substance H on the patient's red cells was carried out using Diaclon-A1 and Diaclon-H cards (DiaMed). The results of the absorption/elution and search for substances A and H on the red cells confirmed the weak variant of A, supporting a differential diagnosis between Am and Aend. In order to identify the variant definitively, substances A and H were searched for in the saliva, given that the patient was a secretor [Le(a-b+) phenotype]. The patient's saliva was heatinactivated to prevent salivary enzymatic activity and was then used to inhibit the reaction between anti-A and anti-H antibodies on target red cells. Diluted anti-A antiserum (1:128,1:256,1:512), a monoclonal anti-H antiserum (H-card, DiaMed) and test A red cells (A1+A2) were used. The results confirmed the presence of substances A and H in the saliva (table III), thus providing conclusive identification of an Am variant. Subsequent ABO-D determination in the neonate showed very weak agglutination (+) with anti-A and antiAB antiserum, raising the possibility that the maternal Am allele had been inherited by the baby. This hypothesis does, however, need verification when the child is older, given the physiologically low expression of A at birth.

Search for substance A and H in the saliva Substance A +++

Substance H ++

emazie della paziente sono state utilizzate due diverse fonti di anticorpo: un siero monoclonale anti-A (Biotest) diluito 1:2 in soluzione fisiologica e un anticorpo da donatore B con titolo anti-A di 1/128. L'eluato è stato ottenuto utilizzando il reattivo Elu-Kit II (Gamma Biologicals, Immucor Italia, Noverasco di Opera, MI). Lo studio dell'eluato è stato eseguito su NaCl-card e Coombs-card (DiaMed), impiegando sia emazie testo A1 e O commerciali (DiaMed) sia emazie A e O ottenute da pool di donatori. La ricerca della sostanza A1 e della sostanza H sulle emazie della paziente è stata eseguita mediante utilizzo di card Diaclon-A1 e Diaclon-H (DiaMed). I risultati dell'assorbimento/eluizione e della ricerca delle sostanze A e H sulle emazie hanno confermato la variante debole di A, deponendo per una diagnosi differenziale tra Am e Aend. Per identificare con certezza la variante non restava che ricercare la presenza delle sostanze A e H nella saliva, essendo la paziente risultata secretrice [fenotipo Le(a-b+)]. La saliva della paziente è stata inattivata al calore per inibire la funzione enzimatica salivare ed è stata, quindi, utilizzata per inibire la reazione di anticorpi anti-A e anti-H su emazie bersaglio. È stato utilizzato un antisiero anti-A diluito (1:128,1:256,1:512), un antisiero anti-H monoclonale (H-card, DiaMed) ed emazie testo A (A1+A2). I risultati hanno confermano la presenza di sostanza A e H nella saliva (tabella III), consentendo di identificare la variante Am. La successiva determinazione ABO-D del neonato ha evidenziato una debolissima agglutinazione (+) con antisiero anti-A e anti-AB facendo ipotizzare come possibile la trasmissione dell'allele materno Am, da verificare, comunque, in età successiva, stante la fisiologica bassa espressività di A alla nascita.

Discussione Discussion Automatisation of routine tests has indisputable advantages for a immunohaematology laboratory: the levels Blood Transfus 2004; 2: 145-8

L'automazione della routine ha ricadute indiscutibilmente positive all'interno del laboratorio di immunoematologia: si raggiungono livelli di produttività, sicurezza, tracciabilità ed economia impensabili in era 147

D Inverardi et al.

of productivity, safety, traceability and economy far outreach those in the "manual" era. Nevertheless, although miniaturisation and automatisation bring advantages to the organization as a whole, as time passes the laboratory staff inevitably lose dexterity and the understanding necessary to resolve complex and atypical cases rapidly. Although very sophisticated analysis techniques, such as genome analysis of polymorphisms, can be used, these methods are expensive, not widely available and unsuitable for resolving complex situations in the sometimes short times imposed by urgent transfusion needs. A rare blood group in other, less pressing situations, such as the one described here, could be determined by genomic investigations4. Nevertheless, molecular analysis is only theoretically available for the Am variant described here, since it has only been described once5. Reports of genotyping of other rare ABO variants are equally scarce6,7. The molecular techniques investigate the nucleotide sequences of exons VI and VII and the interposing intron of the gene on chromosome 9 which codes for the blood group glycosyltransferases that convert substance H into substance A or B. Mutations in this gene create various defects or deficiencies of these glycosyltransferases, thus modifying the expression of the blood group substances on red blood cells and in secretions. This altered expression can be demonstrated by traditional immunohaematological techniques8-10 which can, as described here, be profitably combined, following the traditional diagnostic pathway, with the routine techniques in immunohaematology laboratories.

"manuale". Tuttavia, la miniaturizzazione e la robotizzazione, se pure avvantaggiano l'organizzazione nel suo complesso, con l'andare del tempo impoveriscono gli operatori della manualità e della cultura necessarie per risolvere rapidamente le situazioni complesse e atipiche. Pur esistendo la possibilità di utilizzare tecniche di analisi molto sofisticate come l'analisi genomica dei polimorfismi, queste tecnologie sono costose, poco diffuse ed inidonee ad affrontare situazioni complesse in tempi talora brevi come quelli imposti dall'urgenza trasfusionale. Altre situazioni non urgenti, come quella qui descritta di una variante gruppoematica rara, possono essere risolte mediante le tecniche di indagine genomica4. Tuttavia, come per la variante Am qui riportata, l'analisi molecolare è solo teoricamente accessibile, essendo stata descritta una volta solamente5. Altrettanto rare sono le segnalazioni di genotipizzazione delle altre varianti rare in ambito ABO6,7. Le tecniche molecolari indagano le sequenze nucleotidiche degli esoni VI e VII e l'introne interposto del gene posto sul cromosoma 9 che codifica per le glicosiltrasferasi gruppoematiche, che convertono la sostanza H in sostanza A o B. Le mutazioni geniche rendono variamente difettose o disponibili queste glicosiltrasferasi provocando un'espressione modificata delle sostanze gruppoematiche sui globuli rossi e nelle secrezioni. Questa espressione modificata è dimostrabile con le tecniche immunoematologiche tradizionali8-10 le quali, come si è qui descritto, possono essere proficuamente abbinate, seguendo l'iter diagnostico tradizionale, alle tecniche di routine presenti nei laboratori di immunoematologia.

References

7) Seltsam A, Hallensleben E, Eiz-Vesper B, et al. A weak blood group A phenotype caused by a new mutation at the ABO locus. Transfusion 2002; 42: 294-301.

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6) Olsson ML, Chester MA. Polymorphisms at the ABO locus in subgroup A individuals. Transfusion 1996; 36: 309-13.

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