EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN SENYAWA ... - PERTANIAN

EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN SENYAWA ANTIOKSIDAN DARI LINTAH LAUT (Discodoris sp.) ASAL PERAIRAN PAMEKASAN Hafiluddin Program Studi Ilmu Kelautan Universitas Trunojoyo Madura email:[email protected]

ABSTRACT Sea slug, Discodoris sp., is an important organism for Pamekasan people, as it is used for nutraceutical and functional food. However there is lack comprehensive scientific study regarding the efficacy of Discodoris sp. in improving people health. The purpose of this study is to determine antioxidant activity from sea slug, and determine the bioactive compounds of sea slug. The experiment was conducted with several stages: sample preparation, extraction bioactive compound, fractionation by TLC and identification of compounds by GC-MS. Discodoris sp. has a potential as nutraceutical and functional food as it contained high protein. Fatty acid content of Discodoris sp. was dominated by unsaturated fatty acids with linolenic acid (C18:3, n-3) as the highest component. Body of Discodoris sp. contained high level of alkaloid, steroid and phenolic compound. The bioactive compounds in the meat of sea slug with ethanol solvent was galoxolide, dibuthyl phthalate, di-n-octhyl phthalate, oleic acid amide, erucylamide, squalene and has an IC50 best antioxidant activity in fraction 5 at 150.92 ppm. Key words: antioksidan, extraction, purification, sea slug (Discodoris sp.) PENDAHULUAN Kondisi dunia yang semakin maju dengan berbagai teknologi telah mendorong penghuninya menjadi manusia modern. Pola hidup manusia yang modern memiliki kesadaran yang rendah terhadap pemeliharaan kesehatan dan lingkungannya. Pencemaran udara di kota-kota besar Indonesia saat ini telah melebihi standar yang ditetapkan Organisasi Kesehatan Dunia (WHO), yaitu 50 mikrogram per meter kubik (μg/m3) (PDPERSI 2009). Pencemaran udara yang telah melebihi standar WHO sangat rawan dalam menimbulkan berbagai gangguan pada kesehatan. Radikal bebas adalah senyawa kimia yang memiliki satu atau lebih elektron tidak berpasangan di kulit terluar sehingga sangat reaktif dan mampu bereaksi dengan protein, lipid, atau DNA. Reaksi antara radikal bebas dan molekul tersebut dapat berujung pada timbulnya suatu penyakit.Radikal bebas pada awalnya diperlukan untuk membunuh mikroorganisme penyebab infeksi dalam tubuh makhluk hidup. Paparan radikal bebas yang berlebihan dan secara terus-menerus dapat menyebabkan kerusakan sel, mengurangi kemampuan sel untuk beradaptasi terhadap lingkungannya, dan pada akhirnya dapat menyebabkan kematian sel yang memicu terjadinya berbagai jenis penyakit degeneratif seperti jantung koroner, tekanan darah tinggi, aterosklerosis, kencing manis dan kanker (PDPERSI 2009). Reaktivitas radikal bebas ini dapat diredam oleh senyawa antioksidan. Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012 Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, Juni 2012

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksidasi molekul lain. Senyawa antioksidan ini akan menyerahkan satu atau lebih elektronnya kepada radikal bebas sehingga dapat menghentikan kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas. Di dalam tubuh terdapat mekanisme antioksidan atau antiradikal bebas secara endogenik. Tetapi bila jumlah radikal bebas dalam tubuh berlebih maka dibutuhkan antioksidan yang berasal dari luar tubuh (eksogenik) (Pratiwi et al., 2006). Lintah laut merupakan anggota kelompok filum mollusca yang tidak memiliki cangkang. Fungsi dari cangkang digantikan oleh sistem perlindungan kimia berupa senyawa aktif dalam tubuhnya. Senyawa aktif ini digunakan lintah laut untuk melindungi diri dari serangan predator maupun gangguan di lingkungannya.Lintah laut banyak ditemukan di daerah pasang surut dengan pantai berlumpur dan tergolong organisme epibentik (Hutomo dan Musa 2005). Lintah laut memiliki senyawa metabolit sekunder yang digunakan sebagai pertahanan diri dari serangan predator (Miyamoto 2006). Lintah laut sudah sejak lama digunakan sebagai obat kuat dan obat penyakit asma bagi masyarakat pesisir (Hafiluddinet al. 2011). Hasil penelitian menyebutkan bahwa lintah laut merupakan sumber protein, lemak dan mineral. Banyak mengandung asam lemak tidak jenuhyaitu 5,57% (Hafiluddin et al., 2011). Lintah laut berpotensi sebagai antioksidan alami. Hasil penelitian Nurjanah et al. (2010) menyebutkan bahwa hasil uji fitokimia dari ekstrak metanol lintah laut diperoleh kelompok alkaloid, steroid, asam amino, saponin dan fenol berperan sebagai antioksidan dengan rendemen yang terbesar, yaitu 5,12% serta aktivitas antioksidan 89,44% dibandingkan dengan pelarut yang lain.Lintah laut jenis Discodoris sp. telah dimanfaatkan sebagai formulasi minuman fungsional dan mempunyai aktivitas antioksidan (Naiu 2010). Hasil penelitian Hafiluddin et al. (2011) menyebutkan bahwa rendemen terbesar ekstrak kasar lintah laut diperoleh dari ekstrak etanol dengan kandungan kimia alkaloid,steroid, fenol, karbohidrat dan gula pereduksi. Ekstrak etanol daging memiliki IC50 antioksidan terbaik yaitu 441,12 ppm. Aktivitas antioksidan pada lintah laut masih tergolong lemah dikarenakan aktivitas tersebut masih diukur pada ekstrak kasarnya. Ekstrak kasar tersebut dimungkinkan masih tercampur dengan senyawa-senyawa lain sebagai pengotor dan melemahkan aktivitas antioksidan di dalamnya.Penelitian tentang pemurnian senyawa antioksidan sangat diperlukan untuk mendapatkan senyawa antioksidan yang lebih murni dengan tingkat aktivitas yang lebih kuat. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengekstraksi dan memurnikan senyawa antioksidan dalam lintah laut yang berasal dari perairan Pamekasan. METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan pada penelitian ini berupa lintah laut. Bahan ekstraksi: kloroform, etil asetat dan etanol. Bahan untuk analisis proksimat, asam amino, asam lemak, mineral dan logam berat. Bahan untuk uji antioksidan: DPPH (1,1-difenil-2pikrilhidrazil) dan BHT (Butylated Hydroxytoluena). Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat tulis, alat-alat gelas, alat ekstraksi dan uji kimia antara lain: Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012 Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, Juni 2012

rotari evaporator Buchi Rotavapor R-205, spektrofotometer UV-VIS Hitachi U-2800, AAS Shimazu-7000, HPLC Varian 940-LC. Preparasi Sampel Penelitian dilakukan dari pengambilan dan preparasi sampel. Lintah laut diambil dari pantai di daerah Pamekasan Madura. Setelah bersih lintah laut dikeluarkan isi perutnya dengan cara membelahnya secara melintang dari oral menuju aboral. dikeringkan sekitar 3-4 hari dengan sinar matahari dan dihaluskan dengan mortal atau blender. Ekstraksi Lintah Laut Ekstraksi dilakukan dengan metode ekstraksi bertingkat, menggunakan perbedaan kepolaran pelarut yang mengacu pada metode Sherif et al. (2008). Sebanyak 50 gram bubuk lintah laut dimasukkan ke dalam gelas erlenmeyer dan ditambahkan dengan 100 ml pelarut kloroform. Campuran dikocok dengan shaker dan dibiarkan hingga terjadi pemisahan, fraksi terlarut dalam kloroform dipisahkan dan dimasukkan ke dalam labu. Ekstraksi menggunakan pelarut kloroform ini dilakukan sampai larutan berwarna jernih. Fraksi ini merupakan fraksi dengan tingkat kepolaran rendah. Kemudian dilanjutkan dengan pelarut yang lain yaitu etil asetat dan etanol. Larutan hasil ekstraksi bertingkat dikeringkan dengan evaporator pada suhu kamar 40 0C. Fraksi-fraksi yang diperoleh kemudian dikeringkan dengan freezdryer. Analisis yang dilakukan pada ekstrak kasar yaitu uji fitokimia (Departemen Kesehatan RI, 1995) dan aktivitas antioksidan (Blois, 1958 dalam Hanani et al., 2005). Fraksinasi Lanjutan Fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik kemudian dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis. Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 F254. Pelaksanaan kromatografi preparatif dilakukan dengan mencari pelarut terbaik terlebih dahulu menggunakan kromatografi lapis tipis. Eluen yang digunakan yaitu heksan, kloroform, etil asetat, metanol dan etanol. Pencarian eluen terbaik dimulai dengan menggunakan eluen tunggal sampai dengan eluen campuran atau perbandingan. Sebanyak 5 ml eluen dimasukkan ke dalam chamber dan ditutup, kemudian dibiarkan beberapa menit sampai larutan menjadi jenuh. Ekstrak kasar yang terpilih dilarutkan dalam pelarutnya, kemudian ditotolkan pada garis bagian bawah yang ditandai pada plat kromatografi lapis tipis dengan menggunakan pipa kapiler dan dikeringkan beberapa menit. Kemudian dimasukkan ke dalam chamber dengan posisi agak tegak, sampel yang ditotolkan berada pada bagian bawah dan diusahakan tidak terendam oleh eluen. Kemudian chamber ditutup dan ditunggu sampai sampel terbawa eluen pada batas atas. Plat kromatografi lapis tipis dikeluarkan dan dikeringkan. Selanjutnya plat dilihat hasilnya dengan menggunakan sinar UV 254 nm. Setelah ditemukan eluen terbaik, dilanjutkan dengan kromatografi preparatif. Prosedur yang dilakukan hampir sama dengan KLT namun dengan ukuran yang lebih besar. Pembuatan preparat dengan menggunakan silika gel 60 F 254 yang dipasang pada lempeng kaca dengan ukuran 20x20 cm. Eluen terbaik yang diperoleh disiapkan Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012 Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, Juni 2012

sebanyak 20 ml dan dimasukkan ke dalam chamber. Larutan sampel ditotolkan pada plat KLT dan dimasukkan ke dalam chamber, setelah dilihat hasilnya dengan sinar UV 254 nm, kemudian setiap fraksi atau masing-masing Rf (Retardation factor) yang dihasilkan dikerok dan dikumpulkan. Hasil pengerokan dilarutkan dengan pelarut yang sama dengan sampel terpilih. Pada fraksi atau Rf yang diperoleh dicek dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Jika pada lempeng KLT masing-masing fraksi hanya terdapat 1 bercak, maka dimungkinkan pemisahan sudah hampir sempurna dan diharapkan diperoleh senyawa tunggal. Analisis yang dilakukan pada masing-masing fraksi (Rf) yang diperoleh yaitu analisis antioksidan dengan metode DPPH menurut Blois (1958 dalam Hanani et al., 2005). Identifikasi Senyawa Aktif Fraksi terpilih dengan nilai aktivitas antioksidan terbaik dilanjutkan dengan melihat komponen senyawa yang terdapat di dalamnya yaitu menggunakan GC-MS. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa dilakukan untuk mendapatkan bobot molekul dan pola fragmentasi dari senyawa murni tersebut. Analisis yang dilakukan pada tahap identifikasi senyawa aktif ini yaitu memilih senyawa yang memiliki puncak tinggi dan dicocokkan dengan senyawa yang ada pada library GC-MS dengan kemiripan >90%. Analisis Aktivitas Antioksidan (DPPH) Aktivitas antioksidan diukur dengan menggunakan metode DPPH (Blois 1958 dalam Hanani et al., 2005). Ekstrak lintah laut dari hasil ekstraksi bertingkat dan hasil pemurnian dilarutkan dalam metanol dengan konsentrasi 200, 400, 600 dan 800 ppm. Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dan kontrol positif, dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol dengan konsentrasi yang sama dengan sampel. Larutan DPPH yang akan digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mM. Masing-masing sampel uji dan pembanding diambil 4,50 ml dan direaksikan dengan 500 µl larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi yang berbeda dan telah diberi label. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit dan diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-VISpada panjang gelombang 517 nm. Absorbansi dari larutan blanko juga diukur untuk melakukan perhitungan persen inhibisi. Larutan blanko dibuat dengan mereaksikan 4,50 ml pelarut metanol dengan 500 µl larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi. Nilai persentase aktivitas antioksidan dihitung dengan rumus: Absorbansi blanko - Absorbansi sampel % Inhibisi  x 100% Absorbansi blanko

Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012 Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, Juni 2012

HASIL DAN PEMBAHASAN RendemenEkstrak Kasar Lintah Laut Hasil analisis rendemen dari sampel daging dan jeroan lintah laut dengan perbedaan pelarut disajikan pada Tabel 1. Tabel 1.Rendemen ekstrak lintah laut Berat ekstrak

Keterangan Kloroform

Etil asetat

Etanol

Daging lintah laut

4,53%

1,14%

5,08%

Jeroan lintah laut

3,09%

0,86%

6,97%

Tabel 1 menunjukkan bahwa ekstrak etanol memiliki rendemen yang tertinggi yaitu 5,08% (daging) dan 6,97% (jeroan). Tingginya rendemen pada bagian jeroan disebabkan oleh perbedaan ukuran partikel dan kemudahan sel untuk pecah dimana pada bagian jeroan lintah memiliki sifat mudah dihancurkan dibandingkan pada bagian daging lintah laut.

IC50 (ppm)

Aktivitas antioksidan ekstrak kasar lintah laut Keberadaan senyawa antioksidan dalam suatu bahan dapat diketahui melalui uji aktivitas antioksidan. Pengujian aktivitas antioksidan dalam lintah laut dilakukan dengan metode DPPH. Hasil analisis IC50 aktivitas antioksidan lintah laut (Discodoris sp.) dapat dilihat pada Gambar 1. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

3463,55

2526,11

1269,68

832,42

487,23

441,12

Klorofom Klorofom Etil asetat Etil asetat Etanol daging jeroan daging jeroan daging

Etanol jeroan

Perlakuan

Gambar 1.Hasil analisis IC50 aktivitas antioksidan lintah laut (Discodoris sp.) Nilai rata-rata antioksidan lintah laut terbesar didapat pada ekstrak kasar daging lintah laut dengan pelarut etanol dengan IC50 sebesar 441,12 ppm. Perbedaan nilai IC50 antioksidan lintah laut ini disebabkan perbedaan pelarut yang digunakan.

Hasil fraksinasi dengan KLT Eluen terbaik yang diperoleh yaitu etil asetat:metano:air (30:6:5) sesuai dengan yang dilakukan oleh Sherif et al. (2008). Fraksinasi menggunakan KLT dan Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012 Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, Juni 2012

pengamatan dengan sinar UV 254 nm menghasilkan 6 fraksi yang disajikan pada Gambar 2.

Gambar 2. Hasil fraksinasi dengan KLT; (a) kromatografi KLT preparatif, (b) hasil pengecekan dengan kromatografi lapis tipis Aktivitas antioksidan hasil fraksinasi Hasil fraksinasi dengan kromatgrafi lapis tipis preparatif diukur aktivitas antioksidannya dan disajikan pada Gambar 4. 300

271,34

250

243,73

211,77

IC50 (ppm)

200

168,32

150,92

172,21

150 100 50 0 F1

F2

F3

F4

F5

F6

Fraksi

Gambar 4. Hasil analisis IC50 aktivitas antioksidan pada masing-masing fraksi Gambar 4 memperlihatkan bahwa nilai rata-rata aktivitas antioksidan masingmasing fraksi tertinggi diperoleh pada fraksi 5 dengan IC50 sebesar 150,92 ppm. Adanya perbedan nilai aktivitas antioksidan ini disebabkan oleh perbedaan dan jumlah senyawa murni yang terdapat dalam masing-masing fraksi. Identifikasi senyawa hasil fraksinasi Identifikasi senyawa kimia yang terdapat pada fraksi dengan aktivitas antioksidan terbaik yaitu fraksi 5 dengan IC50 sebesar 150,92 ppm dilakukan


menggunakan GC-MS. Hasil identifikasi senyawa pada lintah laut dengan GC-MS dapat dilihat pada Gambar 5 dan Tabel2.

Gambar 5. Kromatogram Senyawa Pada Fraksi 5 (F5) Lintah Laut Dengan GCMS Tabel 2. Pengelompokan senyawa pada fraksi 5 lintah laut dari hasil GC-MS No

Run time

Nama senyawa

Kemiripan (%)

Kelimpahan (%)

1

11,419

Galoksolida

93

0,42

2

12,141

Dibutil ftalat

95

4,29

3

14,902

Oleilamida

97

1,53

4

15,896

Dioktil ftalat

96

6,19

5

17,850

Erusilamid

95

55,26

6

18,240

Skualen

93

4,81

Rumus bangun

Hasil penelitian Costantino et al., (1999) menunjukkan bahwa galoksolid memiliki sifat inhibitor yang lebih selektif dibandingkan dengan quersetin dan sorbinil yang juga memiliki sifat antioksidan.Benzopiran telah digunakan sebagai antioksidan pada mitokodria dan efektif meningkatkan fungsi vitamin E dalam mitokondria serta melindungi dari kerusakan oksidatif (Smith et al., 1999). Hasil penelitian menyebutkan bahwa dibutil ftalat dapat memberikan efek pencegahan terhadap stres oksidatif pada embrio tikus (Kim et al. 2002). Skualen merupakan antioksidan alami yang berfungsi Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012 Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, Juni 2012

sebagai anti radikal dan antioksidan (Amarowicz, 2009).Triterpen juga ditemukan bersifat proaktif dalam mencegah terjadinya penyakit karsinogenik (Huang et al., 2009). Berdasarkan hasil analisis fitokimia dalam lintah laut (Discodoris sp.) bahwa dalam daging lintah laut dengan pelarut etanol dinyatakan positif kuat mengandung senyawa steroid atau golongan triterpen. Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam satuan isoprene dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon C30 asiklik, yaitu skualena. Skualen terdeteksi terdapat pada fraksi 5 (F5) dalam daging lintah laut dengan pelarut etanol. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Rendemen ekstrak kasar tertinggi pada ekstrak etanol 5,08% (daging) dan 6,97% (jeroan) dengan senyawa kimia yang terdeteksi: alkaloid, steroid, saponin, molisch dan ninhidrin. Aktivitas antioksidan (IC50) tertinggi pada daging yang diekstraksi dengan etanol yaitu 150,92 ppm dan senyawa yang diduga sebagai antioksidan yaitu skualen. Saran Saran yang bisa diambil dari hasil penelitian ini adalah perlunya dilakukan metode ekstraksi yang lain yaitu menggunakan suhu dingin untuk mencegah terjadinya kerusakan senyawa bioaktif antioksidan dalam lintah laut. Melakukan pemurnian dengan kromatografi kolom untuk memperoleh senyawa yang lebih selektif.Melakukan pengujian aktivitas dan toksisitas terhadap senyawa yang ditemukan dalam lintah laut. DAFTAR PUSTAKA Amarowicz R. 2009. Squalene: a natural antioxidant?.European Journal Lipid Science Technology.111:411–412. Costantino L, Giulio R, Maria CG, Joe AV, Pratima B, Anna I, Mariagrazia S, Luciano A, Antonella DC, Umberto M, and Albano A. 1999. 1-Benzopyran4-one Antioxidants as Aldose Reductase Inhibitors.Journal of Medical Chemestry.42(11):1881–1893. Departemen Kesehatan Republik Indonesia.1995. Materia Medika Indonesia. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Hafiluddin, Nurjanah, Tati Nurhayati. 2011. Kandungan gizi dan karakterisasi senyawa bioaktif lintah laut (discodoris sp.). Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan 3(1): 1-6. Hanani E, Mun’im A, Sekarini R. 2005. Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam Spons Callyspongia sp.dari Kepulauan Seribu.Majalah Ilmu Kefarmasian, 2(3):127 – 133. Huang ZR, Lin YK, Fang YJ. 2009. Biological and pharmacological activities of squalene and related compounds: Potential uses in cosmetic dermatology. Molecules.14:540–554. Hutomo M, and Moosa MK. 2005. Indonesian marine and coastal biodiversity: Present status. Indian Journal of Marine Sciences 34(1): 88-97. Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012 Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, Juni 2012

Kim SH, Kim SS, Kwon O, Sohn KH, Kwack SJ, Choi YW, Han SY, Lee MK, Park KL. 2002. Effects of dibutyl phthalate and monobutyl phthalate on cytotoxicity and differentiation in cultured rat embryonic limb bud cells; protection by antioxidants.Jounal of Toxicology and Environmental Health A.65(6):461-72. Miyamoto T. Selected Bioactive Compounds from Japanese Anaspideans and Nudibranchs. Pp. 199-214. In: Climino G, and Gavagnin M. (eds). Molluscs: From Chemo-ecological Study to Biotechnological Application. Springer. Berlin. Naiu AS. 2011. Formulasi minuman fungsional berbahan baku lintah laut. [Tesis]. Sekolah Pascasarjana IPB. Bogor. Nurjanah, Hardjito L, Monintja DR, Bintang M, Agungpriyono DR. 2010. Karakterisasi Lintah Laut (Discodoris sp.) sebagai antioksidan dan antikolesterol.[Disertasi]. Sekolah Pascasarjana IPB. Bogor. Pratiwi, Dewi P, Harapini M. 2006. Nilai peroksida dan aktivitas anti radikal bebas diphenyl picril hydrazil (DPPH) ekstrak metanol Knema laurina. Majalah Farmasi Indonesia. 17(1):32-36. PDPERSI (Pusat Data dan Informasi Rumah Sakit Seluruh Indonesia). 2009. Awas! Kondisi Lingkungan Buruk Pemicu Radikal Bebas. Jakarta. Sherif SE, Edrada RA, Lin W dan Procksch P. 2008. Methods for isolation, purification and structural elucidation of bioactive secondary metabolites from marine invertebrata.Nature Protocols.3(12):1820-1831. Smith RA, Porteous CM, Coulter CV, Murphy MP. 1999. Selective targeting of an antioxidant to mitochondria. European journal of biochemistry. 263(3):709-716.
