Fast Report! - Chinese Journal of Cancer

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Ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ， ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ｓｕｒｇｅｒｙ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｍ ｈａｖｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｍ ｔｏ ｓｏｍｅ ｅｘｔｅｎｔ， ｂｕｔ ｔｈｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｒａｔｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｍ ａｆｔｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｓ ｓｔｉｌｌ ａｓ ｈｉｇｈ ａｓ ３９％－６３％． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｉｔ ｉｓ ｖａｌｕａｂｌｅ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ａ ｎｅｗ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｔｈｅ ｒｅｃｕｒｒｅｃｅ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｍ， ｔｈｕｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ５－ｙｅａｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ． Ｆｏｌｋｍｅｎ ［１］ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ａ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ ｔｈａｔ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｌｉｅｓ ｏｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃａｎ ｔｒｅａｔ ｎｅｏｐｌａｓｍ ３０ ｙｅａｒｓ ａｇｏ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｖｅｓｓｅｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ （ＨＣＶＥＣｓ） ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｍｍｕｎｉｚｅ ａｎｉｍａｌｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ａ ｌａｒｇｅ ｖｏｌｕｍｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ， ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ， ａｎｄ ｔｒｅａｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ， ｔｈｕｓ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｂａｓｉｓ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｖｅｓｓｅｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ

C MY K

ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｍ． ． Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ

．１ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ

ＨＣＶＥＣｓ， ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ （ＨＬＳＥＣｓ） ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ （ＨＵＶＥＣｓ） ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ， ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ， ｆｒｅｓｈ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｅ ｂｙ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ Ｆｒｉｅｎｄｓｈｉｐ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ［２， ３］． Ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＢＥＬ７４０２ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＳＰ２／Ｏ－ＡＧ１４ （ｓｈｏｒｔ ｆｏｒ ＳＰ２／Ｏ） ｗｅｒｅ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｏｕｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ． Ｆｅｍａｌｅ ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ， ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ （ｎｕ／ｎｕ） ｏｆ ６－８ ｗｅｅｋ ｏｌｄ ｗｅｉｇｈｉｎｇ １４－１６ｇ ｗｅｒｅ ｂｏｕｇｈｔ ｆｒｏｍ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． ［ａｎｉｍａｌ ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ： ＳＣＸＫ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） ２００２－０００３）， ａｎｄ ｆｅｄ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｎａ ＰＵＭＣ Ｈｏｓｐｉｔａｌ． ＤＭＥＭ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｆａｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ） ｗｅｒｅ ｂｏｕｇｈｔ ｆｒｏｍ Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ． Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ （ＥＣＧＳ） ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｉｎ ｏｕｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ［４］． Ｇｅｌａｔｉｎｅ， ＭＴＴ ａｎｄ ｂｉｏｔｉｎ ｍａｒｋｅｄ ｈｏｒｓｅ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｗｅｒｅ ｂｏｕｇｈｔ ｆｒｏｍ Ｓｉｇｍａ． ＳＢＡ Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ／ＨＲＰ ｗａｓ ｂｏｕｇｈｔ ｆｒｏｍ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ， ａｎｄ ｓｕｐｅｒＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ ｗａｓ ｂｏｕｇｈｔ ｆｒｏｍ Ａｐｐｌｙｇｅｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ． Ｌｔｄ．

．２ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２．２．１ Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ

ＨＣＶＥＣｓ， ＨＬＳＥＣｓ ａｎｄ ＨＵＶＥＣｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ １００μｇ／ｍｌ ＥＣＧＳ Ｍ１９９ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｏｔｔｌｅｓ ｏｒ ｐｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ ２％ ｇｌａｔｉｎｅ ｂｅｆｏｒｅ ｕｓｅ． Ｄｏｒｍａｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ （ＨＬＳＥＣ ａｎｄ ＨＵＶＥＣ） ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ０．１％ ＦＢＳ， Ｍ１９９ ｎｏｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ＥＣＧＳ． ＢＥＬ７４０２ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ＲＰＭＩ－１６４０ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ ＦＢＳ． ＳＰ２／０ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ＤＭＥＭ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ ＦＢＳ， ａｎｄ ＨＡＴ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｗｈｅｎ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ．

２．２．２ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｓｉｏｎ

ＨＣＶＥＣｓ ｗｅｒｅ ｆｉｘｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ， ６ ! １０６ ＨＣＶＥＣｓ ｗｅｒｅ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ｉｍｍｕｎｉｚｅ ｅａｃｈ

ｍｏｕｓｅ， ｅｖｅｒｙ ｏｔｈｅｒ ｗｅｅｋ ｆｏｒ ８ ｍｏｎｔｈｓ． Ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｔａｉｌ ｉｎ ｅｖｅｒｙ ｍｏｎｔｈ， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ＨＣＶＥＣ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｄｉｄ ｎｏｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ａｎｙ ｍｏｒｅ， ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＨＣＶＥＣｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｒｕｍ． Ｍｏｕｓｅ ｓｐｌｅｅｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｓｔ ｔｉｔｅｒ ｗｅｒｅ ａｄｏｐｔｅｄ ａｎｄ ｆｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ＳＰ２／０ ｃｅｌｌｓ， ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｏｎｔｏ ｔｈｅ ｆｌａｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｆｏｒ ８－１０ ｄａｙｓ， ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ ｇｒｏｗｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ａ ９６－ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ， ｔｏ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ７－１４ ｄａｙｓ， ｔｈｕｓ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＨＣＶＥＣｓ．

２．２．３ Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ

Ｉｎｏｃｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ， ａｎｄ ｆｉｌｌ ｔｈｅ ｗｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｏ ７０％ ｏｆ ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ． Ｗｈｅｎ ＨＬＳＥＣ ａｎｄ ＨＵＶＥＣ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ， ｍａｉｎｔａｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ， ａｎｄ ｃｈａｎｇｅ ｗｉｔｈ ｄｏｒｍａｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ ＦＢＳ ｗｉｔｈ ｎｏ ＥＣＧＳ． Ａｆｔｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｅａｃｈ ｗｅｌｌ ｗｅｒｅ ｗａｓｈｅｄ ｗｉｔｈ ＰＢＳ， ｓｅａｌ ｗｉｔｈ ＰＢＳ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｕｎｄｅｒ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｔｈｅｎ ａｄｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｄｉｌｕｔｅｄ ｔｏ １：２， ｏｒ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－β ｔｕｂｌｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｓｉｇｍａ， ｄｉｌｕｔｉｏｎ １：１ ０００）． Ｔｈｅｎ ｉｎｃｕｂａｔｅ ｆｏｒ １ ｈｏｕｒ ｕｎｄｅｒ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ａｄｄ ｂｉｏｔｉｎ ｍａｒｋｅｄ ｈｏｒｓｅ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ａｆｔｅｒ ｗａｓｈｉｎｇ （Ｖｅｃｔｏｒ， ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＩｇＭ ｍａｙ ｂｅ ｉｎｄｕｃｅｄ， ｄｉｌｕｔｉｏｎ １：４００）， ａｎｄ ｉｎｃｕｂａｔｅ ｆｏｒ ３０ｍｉｎ ｕｎｄｅｒ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． Ａｄｄ ｃｙ３ ｍａｒｋｅｄ Ａｖｉｄｉｎ ａｆｔｅｒ ＰＢＳ ｆｌｕｓｈｉｎｇ （Ｊａｃｋｓｏｎ， ｄｉｌｕｔｉｏｎ １：１ ０００）， ｉｎｃｕｂａｔｅ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎ ｕｎｄｅｒ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｗａｓｈ ｗｉｔｈ ＰＢＳ， ｓｅａｌ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＰＢＳ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ ａｎｄ ５０％ ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｃｏｖｅｒ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ．

２．２．４ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ

ＭＴＴ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｕｓｅ ｓｅｒｕｍ ｏｎ ＨＣＶＥＣ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｃｅｌｌ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｓｅｎｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ （ＲＴ－ＣＥＳＴＭ） ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ＨＣＶＥＣ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ［５］， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ． Ａｆｔｅｒ ８－１６ ｈｏｕｒｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ， ａｄｄ １：２ ｄｉｌｕｔｅｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｒ ＳＰ２／０ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ （ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）， ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ． Ｓｔｏｐ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｅｆｏｒｅ ｃｅｌｌｓ

C MY K

ｅｎｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｐｌａｔｅａｕ ｐｈａｓｅ， ａｎｄ ｃａｌｃｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｏｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．

２．２．５ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ

Ｄｉｌｕｔｅ Ｍａｔｒｉｇｅｌ （ＢＤ） ｗｉｔｈ ＤＭＥＭ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｔｗｏ ｔｉｍｅｓ， ａｎｄ ａｄｄ ５０μｌ ｉｎｔｏ ｅａｃｈ ｗｅｌｌ． Ｐｌａｃｅ ｔｈｅ ｐｌａｔｅ ｕｎｄｅｒ ５％ ＣＯ２ ａｔ ３７! ｆｏｒ １ ｈｏｕｒ ａｎｄ ｃｏａｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｇｅｌ． Ｐｒｅｐａｒｅ １ " １０５／ｍｌ ｓｉｎｇｌｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ ＦＢＳ． Ｉｎ ｅａｃｈ ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ， ａｄｄ １００μｌ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ． Ｉｎｊｅｃｔ １００μｌ （１ " １０４ ｃｅｌｌｓ） ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｔｏ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｅａｃｈ ｗｅｌｌ ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｍａｔｒｉｇｅｌ． Ｅａｃｈ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｓｅｔ ｔｈｒｅｅ ｄｕａｌ ｗｅｌｌｓ， ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｕｎｄｅｒ ５％ ＣＯ２ ａｔ ３７! ．Ｔｈｅ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｆｏｒ ５ｈ．

２．２．６ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ

ａｎｄ

ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆ

Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｕｂｔｙｐｅ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｋｉｔ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｎｔｅｃｈ， ａｎｄ ＩｇＭ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｉｔｒａｐ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎ． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ．

２．２．７ Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｔｅｓｔ ｉｎ ｖｉｖｏ

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｔｅｓｔ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｏｕｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ［６］． Ｅｉｇｈｔｅｅｎ ＢＡＬＢ／ｃ ｎａｋｅｄ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｒｏｕｐ， ｌｏｗ ｄｏｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＰＢＳ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｗｉｔｈ ｓｉｘ ｍｉｃｅ ｉｎ ｅａｃｈ． Ｅａｃｈ ｍｏｕｓｅ ｗａｓ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｆｏｕｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ＨＣＶＥＣｓ ａｎｄ ｏｎｅ ｍｉｌｌｉｏｎ ＢＥＬ７４０２ ｃｅｌｌｓ． Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｍｉｘｅｄ， ｔｈｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ｗａｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｉｃｅ． Ｆｉｖｅ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ （ｗｈｅｎ ｔｕｍｏｒ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｔｏｕｃｈｅｄ）， ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ａｂｄｏｍｉｎａｌｌｙ． Ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｏｎｃｅ ｄａｉｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｗｅｅｋ ｆｏｒ ｆｉｖｅ ｄａｙｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ， ａｎｄ ｔｗｉｃｅ ｉｎ ｅａｃｈ ｗｅｅｋ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｗｅｅｋ． Ｓａｃｒｉｆｉｃｅ ｔｈｅ ｍｉｃｅ ２０ ｄａｙｓ ｌａｔｅｒ ａｎｄ ｗｅｉｇｈ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒｓ， ｃａｌｃｕｌａｔｅ ｔｕｍｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ： ｔｕｍｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ＝１－（ｍｅａｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｗｅｉｇｈｔ ｉｎ ｔｅｓｔ ｇｒｏｕｐ／ ｍｅａｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｗｅｉｇｈｔ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ" １００％）

２．２．８ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ ｄｅｎｓｉｔｙ （ＭＶＤ） ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ

Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｗｉｔｈ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ Ⅷ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ

ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｂｉｏｔｉｎ ｍａｒｋｅｄ ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ａｎｄ ＨＲＰ－Ａｖｉｄｉｎ ａｓ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ． Ｔｈｅ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｖｅｓｓｅｌｓ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ＨＣＶＥＣ ｗｅｒｅ ｍａｒｋｅｄ ｂｙ ｆａｃｔｏｒ Ⅷ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｕｎｄｅｒ ａ １００" ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ， ｉｎ ｔｈｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｓｌｉｃｅｓ ｏｆ ｅａｃｈ ｍｏｕｓｅ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ＰＢＳ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｔｈｒｅｅ ｖｉｓｉｏｎ ｆｉｅｌｄｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍｌｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｖｅｓｓｅｌ ｎｕｍｂｅｒｓ ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｅａｃｈ ｖｉｓｉｏｎ ｆｉｅｌｄ， ａｎｄ ＭＶＤ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ［７］． ＭＶＤ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ＝１－ （ＭＶＤ ｍｅａｎ ｏｆ ｔｅｓｔ ｇｒｏｕｐ／ＭＶＤ ｍｅａｎ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ" １００％）．

２．２．９ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ

Ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ ＨＣＶＥＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｔｅｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｍｅｔｈｏｄ， ｉｓｏｌａｔｅ ３０μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｇｅｌ ｔｏ ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ （０．７５ｍＡ／ｃｍ２， ２ｈ） ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｅｍｉ－ｄｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｔｈｏｄ． Ｓｅａｌ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｗｉｔｈ ５％ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｍｉｌｋ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ａｔ ４! ， ｉｎｃｕｂａｔｅ ｗｉｔｈ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ａｔ ３７! ｆｏｒ １ｈ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｎｃｕｂａｔｅ ｗｉｔｈ ＨＲＰ ｍａｒｋｅｄ ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （１：１ ０００） ａｔ ３７! ｆｏｒ １ｈ ａｆｔｅｒ ｗａｓｈｅｄ ｗｉｔｈ ＰＢＳ－Ｔ． Ｗａｓｈ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｗｉｔｈ ＰＢＳ－Ｔ ｆｏｒ ｆｏｕｒ ｔｉｍｅｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐ ｃｏｌｏｒ ｗｉｔｈ ＥＣＬ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ．

２．２．１０ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ

Ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｓｔｕｄｅｎｔｓ ｔ ｔｅｓｔ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｒｅｃｏｒｄ ｔｈｅ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｄａｔａ ｖａｌｕｅｓ， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍ ｏｆ # ｓ， ａｎｄ Ｐ＜０．０５ ｗａｓ ｓｅｔ ａｓ ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｌｅｖｅｌ． ． Ｒｅｓｕｌｔｓ

．１ Ａｎｉｍａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｒｕｍ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

Ｔｅｎ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ． Ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ， ｔｈｉｒｄ， ｆｉｆｔｈ， ｓｅｖｅｎｔｈ ａｎｄ ｅｉｇｈｔｈ ｍｏｎｔｈ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｔｉｔｅｒｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｒｕｍ ｗｅｒｅ １：１ ０００， １：９ ０００， １：２７ ０００， １： ４０ ０００ ａｎｄ １：４０ ０００． Ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｈａｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ ｗｏｕｌｄ ｎｏｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ７ ｍｏｎｔｈ ｌａｔｅｒ． Ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｒｕｍ ｏｎ ＨＣＶＥＣｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｖｅｎｔｈ ｍｏｎｔｈ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＭＴＴ， ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｒｕｍ ｏｎ ＨＣＶＥＣｓ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｏｂｖｉｏｕｓ ｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ （ｆｉｇｕｒｅ １）．

．２ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ＪＣＶＥＣ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ

Ａｆｔｅｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｓｉｏｎ， １ ４４２ ｌａｒｇｅｒ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｇｒｏｗｉｎｇ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｄｉｕｍ， ａｎｄ ｗｅｒｅ

C MY K

ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ １１９ ｓｐｅｃｉａｌ ａｎｔｉ－ＨＣＶＥＣ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ＨＣＶＥＣ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ， ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ＳＰ２／０ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｅｉｇｈｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＣＶＥＣｓ， ａｎｄ １６ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｕｌｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ＨＣＶＥＣ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ （ｆｉｇｕｒｅ ３）． ＭＴＴ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｒｅｐｅａｔ ｔｈｅ ｔｅｓｔ， ａｎｄ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．

３．４．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｎ ＨＣＶＥＣ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ

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ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ａ ９６－ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｈｙｂｒｉｏｄｏｍａ ｇｒｏｗｔｈｓ ｉｎ １ ２０１ （７０．９％ ） ｃｌｏｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ． Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ １ ２０１ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｌｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ２３７ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＨＣＶＥＣｓ． Ｄｏｒｍａｎｔ ＨＵＣＥＣ ａｎｄ ＨＬＳＥＣ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ２３７ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｗｏ ｎｏｒｍａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ， ｉｎ ｗｈｉｃｈ ９８ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ＨＵＶＥＣ， ８２ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ＨＬＳＥＣ， ａｎｄ １１９ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｄ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｎｅｉｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅｍ， ａｎｄ ｔｈｅｙ ｈａｄ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ＨＣＶＥＣｓ． Ｉｎ ｆｉｇｕｒｅ ２， ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｌｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ １Ｂ１１， １２Ｄ９ ａｎｄ ＨＣＶＥＣ ｗｅｒｅ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ．

Ｖｅｓｓｅｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ １１９ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ＨＣＶＥＣ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＳＰ２／０ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ａｓ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｔｈａｔ， ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｒｒａｎｇｅｄ ｔｏ ｔｕｂｅ ｓｈａｐｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ３ ｈ ｉｎ ｔｈｅ ＳＰ２／０ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ａｎｄ ｔｈｅ ｔｕｂｅ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ５ ｈ ｌａｔｅｒ， ａｎｄ ｔｙｐｉｃａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗａｓ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｌｉｎｋａｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｕｂｅｓ， ｌａｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ６ ｈ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ （ｆｉｇｕｒｅ ４Ａ）． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｈａｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＣＶＥＣ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｆｏｒｍ ｔｕｂｅｓ， ｏｒ ｎｅｔｗｏｒｋ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｔｕｂｅｓ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ （ｆｉｇｕｒｅ ４Ｂ）， ａｎｄ ｔｈｅ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｏｓｔｐｏｎｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ． Ｔｈｅ ｂｒａｎｃｈ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ｕｎｄｅｒ １００ ! ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ ｗａｓ ｔａｋｅｎ ａｓ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ｉｎ １１９ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ， ３６ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｄ ＨＣＶＥＣ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ７ ｏｆ ｔｈｅｍ ｃｏｕｌｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ＨＣＶＥＣ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ．

．３ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ＨＣＶＥＣ

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｋｉｔ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｎｔｅｃｈ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ １１９ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｔｉ－ＨＣＶＥＣ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｌｏｎｅｓ． Ｉｔ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｔｈａｔ， ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ９４ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ＩｇＭ ａｎｔｉｂｏｄｙ （７９．０％）， ５ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ （６．７％ ）； １０ ｃｌｏｎｅｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ， ａｎｄ ７ ｃｌｏｎｅｓ ｗｉｔｈ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ． Ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ １１９ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｓｕｂｔｙｐｅｓ， ｎｏ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｃｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ．

．４ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｏｆ ａｎｔｉ－ＨＣＶＥＣ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ３．４．１ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｎ ＨＣＶＥＣ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

ＭＴＴ ａｎｄ ＲＴ－ＣＥＳＴＭ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ

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ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｖｅｓｓｅｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ ｗｉｔｈ ＨＣＶＥＣ ｐｒｏｄｕｃｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ， ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ （２００μｇ ｏｎｃｅ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｍｏｕｓｅ） ａｎｄ ｌｏｓｅ ｄｏｓｅ （５０μｇ ｏｎｃｅ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｍｏｕｓｅ） ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｔｕｍｏｒ．

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Ａｆｔｅｒ ａｎｔｉ－ＨＣＶＥＣ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ １５ ｄａｙｓ （２０ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ）， ｈａｒｖｅｓｔ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｔｕｍｏｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ （０．８１! ０．１９） ｇ； ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｔｕｍｏｒ ｗｅｉｇｈｔｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｎｄ ｌｏｗ １Ｂ１１ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ （０．１９! ０．１７） ｇ ａｎｄ （０．４１! ０．１６） ｇ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｏｆ １Ｂ１１ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ７６．５％ ａｎｄ ４９．４％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｔｕｍｏｒ ｗｅｉｇｈｔｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｎｄ ｌｏｗ １２Ｄ９ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ （０．２７! ０．１７） ｇ ａｎｄ （０．４６ ! ０．１２） ｇ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ａｎｄ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ６６．７％ ａｎｄ ４３．２％ ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｉｎ ｎａｋｅｄ ｍｏｕｓｅ ｉｎ ｈｉｇｈ ａｎｄ ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （Ｐ＜０．０５）．

３．５．２ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ

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．５ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ａｎｔｉ－ＨＣＶＥＣ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ３．５．１ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ

Ｉｔ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈａｔ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ １Ｂ１１ （ＩｇＭ） ａｎｄ １２Ｄ９ （ＩｇＭ） ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ＨＣＶＥＣ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｈｅ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， ｐｕｒｉｆｙ ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒｏｍ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｅｒｕｍ， ｐｅｒｆｏｒｍ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｔｅｓｔ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ

Ｃｏｕｎｔ ｔｈｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｔｕｍｏｒ ＭＶＤ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ＨＣＶＥＣ ａｆｔｅｒ ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒｓ， ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｔｕｍｏｒ ＭＶＤ ｏｆ ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ２０．４! ５．６， ｔｈｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｔｕｍｏｒ ＭＶＤｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｎｄ ｌｏｗ ｄｏｓｅｓ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ７．２ ! ３．３ ａｎｄ １０．４ ! ４．６， ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ＭＶＤ ｗｅｒｅ ６４．７％ ａｎｄ ４９．１％ ． Ｔｈｅ ＭＶＤｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｎｄ ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ９．２! ４．９ ａｎｄ １２．８! ５．１， ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ＭＶＤ ｗｅｒｅ ５４．９％ ａｎｄ ３７．３％． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ＰＢＳ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｎｏ ｍａｔｔｅｒ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｏｒ ｌｏｗ ｄｏｓｅ， ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｃｏｕｌｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ＨＣＶＥＣ （Ｐ＜０． ０５）．

．６ Ａｎｔｉ－ＨＣＶＥＣ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ

Ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ＨＣＶＥＣ ｔｏ ｐｅｒｆｏｒｍ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｔｈａｔ， ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ １Ｂ１１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ａｂｏｕｔ １００ｋｕ （ｆｉｇｕｒｅ ５）， ｗｈｉｌｅ ｎｏ

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ａｎｔｉｇｅｎ ｂａｎｄ ｏｆ １２Ｄ９ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｉｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ．

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． Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ， ｎｅａｒｌｙ ａｌｌ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ｃａｎ ｂｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ， ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｄａｍａｇｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｖｅｓｓｅｌｓ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ａｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ， ｔｏ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｏｒ ｋｉｌｌ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ ［８］． Ｆｏｒ ｔｈｉｓ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｗｉｔｈ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｖｅｓｓｅｌ ａｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ， ｏｎｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｄｒｕｇ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｃａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄａｍａｇｅ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｖｅｓｓｅｌ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｉｔ ｉｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ， ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｄｏｓｅ ｉｓ ｓｍａｌｌ， ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｏｕｌｄ ｎｏｔ ｂｅ ｅａｓｉｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｎｏｔ ｍａｎｙ ｒｅｐｏｒｔｓ ｏｎ ｎｅｗ ｄｒｕｇ ｗｉｔｈ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｖｅｓｓｅｌ ａｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ， ａｎｄ ｎｏ ｒｅｐｏｒｔ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｅｅｎ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｖｅｓｓｅｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｅ ｒｅａｓｏｎｓ ｍａｙ ｂｅ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓ： （１） ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ， ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｒｅ ｎｏｔ ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｖｅｓｓｅｌｓ， ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｅｎｏｕｇｈ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｖｅｓｓｅｌｓ； （２） ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｉｓ ｎｏｔ ａｄｖａｎｃｅｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， ｓｃｒｅｅｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｖｅｓｓｅｌｓ； （３） ｎｏ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｉｓ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｖｅｓｓｅｌｓ． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｖｅｓｓｅｌ ｉｓ ｆａｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈａｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ， ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｉｔ ｇｒｅａｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎａｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｍｏｄｅｌ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｒｕｇ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｖｅｓｓｅｌｓ ［９］． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａ ｌａｒｇｅ ｖｏｌｕｍｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏ ＨＣＶＥＣ． Ｗｈｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ＨＣＶＥＣ， ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｆｉｘｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ， ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｗａｓ ｉｎｔａｃｔ， ａｎｄ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ａｌｌｏｗｅｄ ｔｏ ｐｅｎｅｔｒａｔｅｄ，

ｓｕｃｈ ａｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｅｔｃ． ［１０］． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｗｈｅｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ， ｉｔ ｗａｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ， ａｎｄ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｔａｋｅｎ ａｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｒｅｓｉｓｔ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｅｔｃ． ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｔ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｎａｋｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ［６］ ｔｈａｔ ｔｗｏ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｃｏｕｌｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｔｈｕｓ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｉｔ ｗａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ， ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｉｔｈ ＨＣＶＥＣ ａｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ １Ｂ１１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｗａｓ ａｂｏｕｔ １００ｋｕ． １２Ｄ９ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｒｅｌｅｖａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ， ｔｈｅ ｒｅａｓｏｎ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｔｈａｔ， ｔｈｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ａ ｓｐａｃｅ ｅｐｉｔｏｐｅ． Ｂｕｔ ｄｕｒｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ｔｈｅ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄａｍａｇｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐａｃｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｄｉｓａｐｐｅａｒｅｄ． Ｗｅ ｗｏｕｌｄ ｕｓｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｒｏｍ ＨＣＶＥＣ， ｖｅｒｉｆｙ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ａｎｄ ｍａｋｅ ｃｌｅａｒ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｌｅｖｅｌ．

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