GODFRAY et al., 2010

14 DAVID ROBERTS CLAUDIO MARCELO GONÇALVES DE OLIVEIRA ROY NEILSON VIVIAN BLOK

Não há dúvida de que o maior desafio global é alimentar a sempre crescente população (GODFRAY et al., 2010), utilizando recurso territorial em declínio (LAMBIN e MEYFROIDT, 2011), que está degradado (BANWART, 2011), sob impacto da mudança climática (IPCC, 2014) e agravado pela instabilidade dos preços de alimentos (UNEP, 2009). De forma conjunta, isto tem impactos visíveis sobre a pobreza em países de baixa renda (DORWARD, 2012; IVANIC e MARTIN, 2012). Cálculos recentes mostraram que, mundialmente, há somente 4000 M ha de solo ainda não cultivado apropriado à agricultura pluvial, principalmente na Savana africana e no Cerrado brasileiro (LAMBIN e MEYFROIDT, 2011). Dessa maneira, há uma significativa premência para se lidar com esta lacuna na produção (VAN ITTERSUM et al., 2013), intensificando-se a produção agrícola nas áreas disponíveis atualmente pelo emprego de regimes sustentáveis de manejo (TILMAN et al., 2010). Uma importante restrição à produção agrícola sustentável é o impacto de pragas e doenças de solo. Por exemplo, estima-se que os nematoides parasitos de plantas (NPP) consomem aproximadamente 10% da produção agrícola global, levando a perdas econômicas anuais avaliadas em mais de U$125 bilhões (CHITWOOD, 2003). Os fun1

Arguably the greatest global challenge is feeding an ever increasing population (GODFRAY et al., 2010) from a decreasing land resource (LAMBIN and MEYFROIDT, 2011) that is degraded (BANWART, 2011), impacted by a changing climate (IPCC, 2014) and underpinned by volatile food prices (UNEP, 2009). Collectively this has demonstrable impacts on poverty in low income countries (DORWARD, 2012; IVANIC and MARTIN, 2012). Globally, recent calculations have suggested that there is only 4000M ha of land suitable for rainfed agricultural production currently not in production mostly comprising African savannah and Cerrado in Brazil (LAMBIN and MEYFROIDT, 2011). Thus there is a significant pressure to address the recognised yield gap (VAN ITTERSUM et al., 2013) by intensifying agriculture production on currently available land by deploying sustainable management regimes (TILMAN et al., 2010). A major constraint to such sustainable agricultural production is the impact of soil-borne pests and pathogens. For example, plant-parasitic nematodes (PPN) are estimated to consume approximately 10% of global agricultural output, leading to annual economic losses conservatively valued at > $125 billion (CHIT-

A tradução da versão original em Inglês para o Português foi preparada pela Drª Rosana Bessi.

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DIAGNOSE DE FITONEMATOIDES C.M.G. OLIVEIRA – M.A. DOS SANTOS – L.H.S. CASTRO

damentos do manejo integrado de nematoides utilizados por produtores têm sido tradicionalmente baseados na rotação de culturas, seleção de cultivares resistentes e aplicação de nematicidas. Entretanto, como a demanda pela produção de alimentos tem aumentado, práticas de rotação têm diminuído ao ponto de que muitas culturas são agora produzidas em monoculturas ou com períodos de rotação significativamente reduzidos, resultando no aumento das populações de nematoides, mas com rendimento, na melhor das hipóteses, estável. Resistência para um determinado NPP tem sido introduzida com êxito em algumas culturas, mas esse processo é lento e as diversidades inter e intraespecífica no campo comprometem a eficiência do método. Consequentemente, houve dependência na aplicação de nematicidas para contribuir no manejo de NPP, às vezes como parte de uma estratégia de manejo integrado (como exemplos: OWEN et al., 2014; FORGE et al., 2015). Entretanto, há limitações ambientais e sociais crescentes, traduzidas em regulamentação que está reduzindo o uso de pesticidas de modo legislativo (por exemplo, EU directive 91/414/ EEC) e levando ao desenvolvimento de métodos para controle de nematoides ambientalmente adequados (por exemplo, HILLOCKS, 2012). Para assegurar que o regime mais apropriado para o manejo de nematoides seja adotado pelos produtores, a correta identificação de espécies de importância econômica é, portanto, crucial.

WOOD, 2003). The cornerstones of integrated nematode management used by growers have traditionally been rotation, breeding for resistant varieties and application of nematicide. However, as demand for food production has increased, rotational practices have diminished to the point where many crops are now grown in monoculture or with significantly reduced periods of rotation directly resulting in increased nematode populations but with at best static yields. Resistance for particular PPN has successfully been introduced into some crops however this process is slow and the inter- and intra-specific diversity of nematodes in the field makes this approach only successful in certain situations. Consequently there has been reliance on the application of nematicides to contribute to the management of PPN sometimes as part of an integrated management strategy (e.g. OWEN et al., 2014; FORGE et al., 2015). However, there are increasing environmental and social pressures, translated into policy that is reducing the general usage of pesticides through legislation (e.g. EU directive 91/414/EEC) resulting in the development of environmentally sensitive methods for nematode control (e.g. HILLOCKS, 2012). To ensure that the most appropriate nematode management regime is deployed by growers, correct identification of economically damaging nematode species is therefore essential.

LGHQWL¿FDomRFRUUHWDGH A identificação de nematoides em nível de espécie é dificultada pela grande diversidade (BOAG et al., 1998; HUGOT et al., 2001) e pelas diferenças ínfimas nos caracteres morfológicos, que exigem um especialista em taxonomia, competência que está em declínio (ANDRÉ et al., 2001; COOMANS, 2002). Normalmente, NPP são um componente menor da comunidade nematológica (BOAG et al.,

Identification of nematodes to species is confounded by their great diversity (BOAG et al., 1998; HUGOT et al., 2001) and minute differences in morphological characters requiring specialist taxonomists which is a decreasing skillbase (ANDRÉ et al., 2001; COOMANS, 2002). Typically, PPN species are a minor component of the overall nematode community

14 – DIAGNOSE MOLECULAR DE NEMATOIDES PARASITOS DE PLANTAS / MOLECULAR DIAGNOSTICS OF PLANT-PARASITIC NEMATODES DAVID ROBERTS – CLAUDIO MARCELO GONÇALVES DE OLIVEIRA – ROY NEILSON – VIVIAN BLOK

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1998; GRIFFITHS et al., 2012; CHEN et al., 2014). Além disso, espécies economicamente danosas frequentemente coexistem com espécies benignas do mesmo gênero, destacando a importância da identificação acurada de espécies. Por exemplo, espécies vetoras de vírus de Longidoridae e Trichodoridae foram relatadas ocorrendo em solos com espécies não vetoras (e.g. ALPHEY e BOAG, 1976; LAMBERTI et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2003; DUARTE et al., 2011). Dessa forma, a identificação incorreta de espécies poderia resultar na aplicação desnecessária de nematicida, com consequências financeiras e ambientais. Identificação de nematoides usando microscopia é uma atividade demorada, com rendimento estimado em aproximadamente 10 amostras por dia para um nematogista experiente. Entretanto, avanços nas técnicas moleculares oferecem a oportunidade para o desenvolvimento de diagnósticos que diferenciam espécies consistentemente, que podem ser usados por não especialistas e com rendimento diário de análise, após a extração dos nematoides do solo, aumentado no mínimo dez vezes. Ademais, estudos moleculares apresentam o potencial de esclarecer controvérsias taxonômicas relacionadas às espécies de NPP (OLIVEIRA et al., 2006). À medida que a tecnologia e o entendimento da química molecular avançam, o custo da diagnose molecular diminui significativamente ao ponto de um genoma completo ser sequenciado por menos de US$ 1000 (HAYDEN, 2014), conduzindo para a fronteira do conhecimento em diagnósticos.

(BOAG et al., 1998; GRIFFITHS et al., 2012; CHEN et al., 2014). Furthermore, economically damaging species frequently co-exist with benign species of the same genus highlighting the importance of accurate species identification. For example, virus-vector species of the Longidoridae and Trichodoridae have been reported to occur in soils with non-vector species (e.g. ALPHEY and BOAG, 1976; LAMBERTI et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2003; DUARTE et al., 2011). Thus, incorrect species identification could result in an unnecessary application of nematicide with environmental and financial consequences. Nematode identification using microscopy is time consuming with sample throughput measured in approximately 10 samples per day for an experienced nematode taxonomist. However, advances in molecular techniques offer the opportunity to develop diagnostics that robustly differentiate species that can be used by non-specialists with sample throughput on a daily basis, post nematode extraction from soil, increased at least by a factor of 10. In addition, molecular studies have the potential to clarify taxonomic controversies surrounding PPN species (OLIVEIRA et al., 2006). As technology and the understanding of molecular chemistry advances, the cost of molecular diagnostics decreases significantly to a point where a full genome can be sequenced for < $1000 (HAYDEN, 2014) leading to the next advance in state-of-the-art diagnostics.

“Diagnóstico molecular”, neste contexto, é um termo amplo descrevendo uma classe de testes de diagnóstico que avaliam a condição geral da planta ou do solo literalmente em nível molecular, detectando e quantificando sequências genéticas específicas no ácido desoxirribonucleico (DNA) ou no ácido ribonucleico

“Molecular diagnostics”, in this context, is a broad term describing a class of diagnostic tests that assess plant or soil health literally at a molecular level, detecting and measuring specific genetic sequences in deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) or the proteins they express. Mo-

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(RNA) ou em proteínas que eles expressam. O diagnóstico molecular identifica variações em gene, RNA e proteína que esclarecem se uma determinada amostra (solo, material vegetal ou água) contém o organismo-alvo do diagnóstico, seja ele bactéria, fungo, vírus ou, ocasionalmente, se a planta hospedeira é resistente a um determinado patógeno. Muitos dos métodos de diagnose permitem quantificar a presença de um alvo específico. A seção anterior discutiu a necessidade por diagnóstico molecular, seja como substituto para os métodos convencionais ou para uso em novas aplicações. Aqui, nós discutiremos tanto as características gerais de um diagnóstico molecular “ideal” como também as metodologias de amostragem e as técnicas para preparação de amostras. Principais considerações para um diagnóstico ideal: • Simples: Não é necessário treinamento ou equipamento especializado. • Rápido: Resultado obtido em um dia (ao menos ‘mais rápido que o usual’). • Discriminativo e sensível. • Confiável: Sem resultado falso-positivo ou falso-negativo . • Multiplicar ou não multiplicar em plasmídeo (clonagem)? • Custo. Dado que um dos maiores custos do diagnóstico tradicional em fitossanidade é mão-de-obra, isto é, treinamento para identificação de patógenos ao microscópio e tempo gasto para processar cada amostra, o diagnóstico molecular ideal deve ser suficientemente simples para que um técnico de laboratório bem treinado possa seguir o protocolo sem treinamento adicional oneroso. A maioria das técnicas moleculares básicas é agora considerada rotineira (por exemplo, PCR, digestão com enzima de restrição). Os equipamentos necessários para a diagnose variam dos acessíveis termocicladores e equipamentos de eletroforese aos altamente especializados e caros aparelhos de PCR em tempo real (qPCR) e


lecular diagnostics identify gene, RNA, and protein variations that shed light on whether a particular sample (soil, leaf material, roots, seeds or water) contains the organisms for which the diagnostic is targeted, be it bacterial, fungal, viral “infections” or, on occasion, whether the plant host has resistance to a known pathogen. Many molecular diagnostics can also quantify the presence of the specific target. The previous section discusses the need for molecular diagnostics, whether as replacements for conventional diagnostic approaches or for new applications. Here we will discuss the general characteristics of an “ideal” molecular diagnostic as well as considerations of sampling methodologies and sample-preparation techniques. General overriding considerations for an ideal diagnostic would be: • Simple: Requiring no specialised training or equipment. • Rapid: Result within one day (at least ‘faster than the old way’). • Discriminative and sensitive. • Reliable: No false positive or false negative results. • To culture or not to culture? • Cost. Given that one of the biggest costs of traditional plant-health diagnostics is labour, i.e. training for microscope identification of pathogens plus the time taken to process each sample. An ideal molecular diagnostic should be sufficiently simple that any welltrained laboratory assistant could perform the necessary steps without additional, expensive training. Most basic molecular biology techniques are now considered commonplace (PCR, restriction-enzyme digestion). The equipment required for molecular diagnostics ranges from relatively inexpensive PCR machines and gel-electrophoresis apparatus up to highly specialised and expensive, quantitative real-time PCR (qPCR) machines


de sequenciamento de alto desempenho. O diagnóstico ideal não exigiria equipamentos caros embora o custo destes e dos reagentes necessários ao diagnóstico deveriam ser contrabalançados com a economia em mão-de-obra. Uma vez que o diagnóstico molecular permite processar muitas amostras ao mesmo tempo, há potencial para redução do custo por amostra em razão da eficiência de escala. A segunda vantagem oferecida pelo diagnóstico molecular é em economia de tempo. A maioria dos protocolos podem ser otimizados para permitir o processamento simultâneo de muitas amostras; normalmente, as amostras são processadas em placas de 96 poços, o que permite que 80 ou mais amostras sejam processadas ao mesmo tempo (deixando espaço para os controles). Além disso, a rapidez desses testes faz com que se obtenha o resultado em horas, enquanto que um diagnóstico “tradicional” demoraria vários dias para avaliar o mesmo número de amostras. A maioria dos diagnósticos moleculares é altamente sensível, sendo frequentemente possível detectar um único indivíduo do organismo-alvo específico por amostra e, geralmente, sem a necessidade de uma etapa demorada de multiplicação da amostra em plasmídeo (clonagem). Esta é uma vantagem, já que a fase de cultura pode frequentemente dificultar a quantificação da concentração inicial do organismo-alvo na amostra. Também, remove-se uma das mais significantes causas de contaminação da amostra, a cultura anterior à análise. Entretanto, no empenho de se desenvolver um diagnóstico altamente sensível, deve-se cuidar para que o diagnóstico continue discriminativo e não gere resultados falso-positivos. Uma consideração adicional: o diagnóstico molecular vai ser um substituto comparável ao sistema atual ou será utilizado como uma abordagem diferente ou será uma aproximação para o original? Enquanto a identificação por microscopia de um nematoide específico (por exemplo) basea-se nas características morfológicas de um nematoide intacto, um típico diagnóstico

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and high-throughput sequencing apparatus. An ideal diagnostic would not require expensive apparatus although the cost of the apparatus, and the associated cost of the reagents required for the diagnostic should be balanced against savings in labour costs. Given that most molecular diagnostics can process many samples at once, this offers a potential cost-saving on each sample processed due to an increased efficiency of scale. The second advantage offered by molecular diagnostics is in time-saving. Most molecular diagnostics can be optimised to allow simultaneous processing of many samples at once; typically samples are processed on a 96-well plate format which can allow 80 or more samples to be processed at once (leaving room for controls). In addition, the rapidity of most molecular diagnostics can give a result within hours when a typical “traditional” diagnostic can take several days to process as many samples. Most molecular diagnostics are highly sensitive, often able to detect individual target organisms per sample and, usually, without any need for a time-consuming culture-phase to enrich the sample. This is an advantage as performing a culture-phase can often lead to complications in terms of quantification of the initial titre of the target in the sample. It also removes one of the most significant causes of contamination of samples, culturing before analysis. However, in the drive to develop a highly sensitive diagnostic care must be taken to ensure that the diagnostic remains discriminative and does not give false positive results. An additional consideration is whether the molecular diagnostic is to be a ‘like-forlike’ replacement of the current system or is it using a different approach and is a proxy for the original? Whilst microscope identification of a specific nematode (for example) is based on morphological features of an intact nematode, a typical DNA-based molec-

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baseado em DNA é orientado para uma sequência específica de DNA, única ao nematoide-alvo. Esta sequência pode estar presente em múltiplas cópias em cada célula do nematoide e cada nematoide terá múltiplas células, o número exato diferindo de acordo com a espécie e/ou estádio de desenvolvimento. Isto pode dificultar a calibração do método. As seguintes observações devem ser consideradas antes de se iniciar a concepção de qualquer diagnóstico.

3UHSDUDomRGDDPRVWUD O tipo de material a ser analisado pelo método proposto afeta os processos de preparação da amostra. Evidentemente, é essencial que amostras apropriadas sejam analisadas para eficientemente detectar e enumerar organismos-alvos. Conhecimento do ciclo de vida do nematoide é essencial para se determinar qual o tipo de amostra mais apropriada para a detecção/enumeração confiável. Seria inútil analisar amostras de folhas para nematoides de solo e seria equivocado analisar amostras de solo para listar nematoides de raízes. Um bom exemplo seria Pratylenchus, endoparasita migrador que pode ser detectado em amostras de solo, mas que permanence a maior parte do seu ciclo de vida dentro das raízes de plantas. Isto significa que a detecção segura de espécies de Pratylenchus deveria envolver amostragem de solo e de raízes. Por outro lado, nematoides Tricodorídeos não penetram as raízes e são detectados em amostras de solo. A estratégia de amostragem e o tamanho da amostra são considerações complementares em relação ao tipo de amostra. NPP tais como Trichodorus e Paratrichodorus tem distribuição altamente agregada que varia no espaço e ao longo do tempo (ROBERTS et al., 2012); observações semelhantes foram feitas para Xiphinema (TAYLOR et al., 1994) e nematoides de cisto (WEBSTER e BOAG, 1992). A estratégia de amostragem é importante já que o foco do nematoide pode não ser encontrado com uma estratégia mal concebida (MARSHALL et al., 1998). O tamanho de amos-


ular diagnostic is targeted at a specific DNA sequence unique to the target nematode. This sequence may be present in multiple copies in each cell of the nematode and each nematode will have multiple cells, the exact number differing by species and/or developmental stage. This can make calibration of a molecular diagnostic complicated. The following are some considerations before beginning any diagnostic design.

The type of sample that will be analysed by the proposed diagnostic affects the sample preparation processes. Clearly it is essential that appropriate samples are analysed to effectively detect and enumerate target organisms. Knowledge of the life cycle of the nematode is essential to determine what sample type would be most appropriate for reliable detection/enumeration. It would be pointless to analyse leaf samples for soil dwelling nematodes and it would be misleading to analyse soil samples to enumerate root living nematodes. A good example would be Pratylenchus, migratory endoparasites which can be detected in soil samples but spend a good deal of their life within the roots of plants. This means that reliable detection of Pratylenchus species should involve sampling of both soil and plant roots. Conversely, trichodorid nematodes do not penetrate the plant root and will be detected in soil samples. Additional considerations related to sample type are the sampling strategy and sample size. PPN such as Trichodorus and Paratrichodorus have a highly aggregated distribution which varies in space and time (ROBERTS et al., 2012); similar observations have been made for Xiphinema (TAYLOR et al., 1994) and cyst nematodes (WEBSTER and BOAG, 1992). The design of nematode sampling strategies is important as nematode foci could be missed with an ill-designed sampling strategy (MARSHALL et al.,


tra adequado é importante para garantir que a diversidade da comunidade de nematoides seja abrangida. Estudos recentes, conduzidos por Wiesel et al. (2015), confirmaram que, para nematoides de solo, amostra menor que 200g não reflete acuradamente a verdadeira composição da comunidade de nematoides. Uma vez que a estratégia de amostragem ecologicamente adequada foi desenhada, deve-se decidir sobre o processamento das amostras. Para a maioria das aplicações em diagnóstico molecular, isso envolve a extração do DNA, diretamente da amostra (por exemplo, material vegetal) ou indiretamente após a recuperação dos nematoides da amostra (geralmente para amostras de solo). Concentrando-se nas amostras de solo, enquanto foi relatado que DNA extraído diretamente do solo pode ser usado para análise de comunidade de nematoides, e, por extensão, pode ser usado para detecção de um nematoide específico, estes protocolos estão extraindo DNA de apenas 1g de solo (por exemplo, WAITE et al., 2003), um volume que hoje acredita-se ser insuficiente para refletir realmente as comunidades de nematoides (WIESEL et al., 2015). Uma alternativa a esse método é primeiro extrair os nematoides do solo e então extrair o DNA diretamente dos nematoides (FOUCHER e WILSON, 2002; HÜBSCHEN et al., 2004a). Métodos para extração de nematoides do solo e outros materiais baseiam-se em um ou mais dos seguintes princípios: • Motilidade dos nematóides, usada em métodos de funil de Baermann, tanto os métodos de incubação como aqueles que usam um pulverizador de névoa de água; • Densidade específica dos nematoides, usada em métodos de flotação/centrifugação, elutriação ou sedimentação; • Tamanho e forma dos nematoides, usados em métodos de peneiramento. Os principais métodos de recuperação de nematoides de diferentes amostras são destacados abaixo. É pouco provável que esta seja uma lista completa, mas abrange os principais métodos

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1998). Collecting an appropriate sample size is an important consideration to ensure the diversity of the nematode community. Recent studies by Wiesel et al. (2015) confirmed that for soil nematodes, a sample of < 200g will not accurately reflect the true nematode community composition. Once an ecologically suitable sampling strategy has been designed, an appropriate decision must be made regarding sample processing. For most molecular diagnostic applications this will involve DNA extraction, either directly from the sample (e.g. from plant material) or indirectly following nematode recovery from the sample (typical for soil samples). Focussing on soil samples, whilst it has been reported that DNA extracted directly from soil can be used to analyse nematode communities, and by extension, can be used for detection of specific nematodes, these protocols are only extracting DNA from 1g of soil (WAITE et al., 2003), a volume that is insufficient to truly reflect nematode communities (WIESEL et al., 2015). An alternative to directly extracting nematode DNA from soil is to first extract the nematodes from the soil and then extract the DNA from the nematodes directly (FOUCHER and WILSON, 2002; HÜBSCHEN et al., 2004a). Methods for extracting nematodes from soil, and other material, are based on one or more of the following principles: • Motility of the nematodes used in Baermann funnel methods as well as incubation methods or those that use a mist spray of water; • Specific density of the nematodes, used in flotation/centrifugation, elutriation or sedimentation methods; • Size and shape of the nematodes, used in sieving methods. The main methods for recovery of nematodes from different samples are highlighted below. This is unlikely to be an exhaustive list but covers the main methods recommend-

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recomendados pea Organização Europeia e Mediterrânea de Proteção de Plantas (EPPO) no Boletim 43(3) “PM 7/119 (1) Nematode extraction” (ISSN 0250-8052. DOI: 10.1111/epp.12077).

ed by the European and Mediterranean Plant Protection Organisation (EPPO) in their Bulletin 43(3) “PM 7/119 (1) Nematode extraction” (ISSN 0250-8052. DOI: 10.1111/epp.12077)

• Formas móveis: funil de Baermann/Oostenbrink, flotação e peneiramento, técnica de Cobb modificada por Flegg, elutriador de Oostenbrink. • Formas móveis e imóveis: método de flotação centrífuga.

• Motile nematodes: Baermann funnel/ Oostenbrink dish, flotation and sieving, Flegg modified Cobb technique, Oostenbrink elutriator • Motile and immotile nematodes: Centrifugal flotation.

• Formas móveis: funil de Baermann/Oostenbrink, nebulizador ou câmara de névoa, incubação de partes vegetais. • Formas móveis e imóveis: Exame direto, maceração e filtração, maceração e flotação centrífuga, digestão enzimática.

• Motile nematodes: Baermann funnel/ Oostenbrink dish, mistifier, incubation of plant parts. • Motile and immotile nematodes: Direct examination, maceration and filtration, maceration and centrifugal floatation, enzymatic digestion.

• Solo seco: método Baunacke, método da tira de papel, técnica de Fenwick, centrífuga de Schuiling. • Solo seco ou úmido: elutriador de Seinhorst, método de flotação centrífuga, Wye washer (elutriador de solo em coluna). O método específico a ser usado para determinada aplicação dependerá do tipo de amostra e das instalações disponíveis, mas deve-se ter cuidado para selecionar o método mais apropriado para maior recuperação dos nematoides da amostra. Uma vez que os nematoides tenham sido recolhidos da amostra, DNA pode der extraído mais facilmente. Uma lista completa dos protocolos de extração de DNA está fora do escopo deste capítulo, mas muitos foram desenvolvidos nas últimas décadas, incluindo aqueles que utilizam kits comerciais de extração de DNA. Estes kits apresentam a vantagem de que o processo de controle de qualidade garante que os reagentes fornecidos pelo fabricante terão qualidade constante e a maioria foi desenvolvida para ser

• Dried soil: Baunacke method, paper strip method, Fenwick can, Schuiling centrifuge. • Wet or dried soil: Seinhorst elutriator, centrifugal floatation, Wye washer. The particular method to be used for a specific application will depend on sample type and the facilities available but care should be taken to use the most appropriate method that will yield the highest recovery of all nematodes from the sample. Once nematodes are recovered from the sample, nematode DNA can be extracted more easily. An exhaustive list of DNA extraction protocols would be beyond the scope of this chapter but a large number have been developed over past decades including many that utilize commercially developed DNA extraction kits. These kits have the advantage that quality control processes ensure that reagents supplied by the manufacturer will be of consistent quality and most are designed


armazenada à temperatura ambiente. Qualquer que seja o método selecionado, deve-se levar em consideração que todos os métodos de extração de DNA apresentam pontos fortes e fracos e que muitos compostos presentes em alguns tipos de amostras (solo, em particular) serão copurificados com o DNA e podem inibir a PCR. Estes compostos inibidores podem estar presentes em níveis variados em diferentes tipos de solo e, assim, para assegurar que qualquer protocolo tenha aplicação universal, um controle interno deve ser incluído na fase de extração de DNA para garantir a padronização das amostras dos diferentes tipos de solo (DANIELL et al., 2012).

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for storage at room temperature. Whichever DNA extraction method is used it must be borne in mind that all DNA extraction methods have strengths and weaknesses and that many compounds are present in some samples types (soil in particular) that will be co-purified with the DNA and can inhibit PCR. These PCR-inhibiting compounds may be present at different levels in different soil types and so, to ensure any protocol is universally applicable, an internal control should be included at the DNA extraction stage to allow normalisation of samples across soiltypes (DANIELL et al., 2012).

9DOLGDomR Todo diagnóstico molecular precisa de validação exaustiva para determinar o nível de correlação entre os números de nematoides obtidos pelos métodos moleculares e os números obtidos por outros métodos, como contagens ao microscópio. A primeira fase da validação envolve análise in-silico, verificando os primers propostos (para diagnóstico baseado em PCR) em relação às sequências de banco de dados público. Neste ponto, é simples encontrar alguma possível reação cruzada entre primers específicos e organismos não alvos. Após a fase in-silico, o diagnóstico deveria ser testado em amostras de DNA de orgasnismos-alvos e não alvo conhecidos. Nessa fase, a sensibilidade pode ser calculada em termos de número mínimo de cópias detectáveis do DNA-alvo, embora este seja apenas um limite teórico de sensibilidade, já que, nesta fase, o DNA molde está perfeitamente limpo e não contém inibidores de PCR. Uma forma mais interessante de se avaliar a sensibilidade do diagnóstico pode ser feita ao testá-lo contra um número conhecido de nematoides. A especificidade do protocolo também deve ser determinada testando-o contra um conjunto de espécies não alvo. Finalmente, o diagnóstico deve ser testado contra o maior número possível de amostras reais. Essa fase destacará qualquer problema envolvendo a metodologia de preparação das amostras, como a inibição

All molecular diagnostics require extensive validation to determine the level of correlation between nematode abundance assessed by molecular methods and the numbers assessed by any other means, e.g. microscope counts. First stages of validation involve in-silico analysis, checking the proposed primers (for PCR-based diagnostics) against public databases of sequences. At this point it is easy to pick up any potential cross-reactions between specific primers and non-target organisms. Following the in-silico stages the diagnostic would be tested against known examples of target and non-target DNA. At this stage the sensitivity can be calculated in terms of minimum detectable number of copies of target DNA, although this is only a theoretical limit of sensitivity as, at this stage, the template DNA is perfectly clean and contains no PCR inhibitors. A more useful measure of sensitivity of the diagnostic can be assessed by testing against known numbers of nematodes. The specificity of the diagnostic should also be determined by testing against a range of non-target species. Finally the diagnostic should be tested against as wide a range as possible of real samples. This stage will highlight any issues involving the sample preparation methodology, e.g.

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de PCR, já que qualquer inibidor copurificado pode afetar significativamente a eficiência da reação (incluindo qPCR). Os diagnósticos baseados em qPCR devem seguir as orientações dadas por Bustin et al. (2009).

PCR inhibition, any PCR inhibitors co-purified with the target DNA can significantly affect the efficiency of PCR (including qPCR). Any diagnostic based on qPCR should follow the guidelines given by Bustin et al. (2009).

A escolha do alvo molecular é um estágio crucial durante o desenvolvimento do diagnóstico, uma vez que decisões tomadas nessa fase afetarão todas as etapas posteriores, e equívocos podem ocasionar atraso significativo. Pode não existir um alvo molecular perfeito, mas um alvo ideal possuiria as seguintes características (explicações são dadas abaixo): 1. Estar presente em todos os organismos-alvos e não alvos estreitamente relacionados. Um aspecto do desenvolvimento do diagnóstico que pode ser facilmente negligenciado é que organismos não alvo estreitamente relacionados não devem dar sinais falso-positivos ou o protocolo pode ser invalidado. Essa situação adversa pode ser evitada pela análise minuciosa da filogenia do(s) organismo(s)-alvo(s), buscando-se, em bases de dados online, sequências para criar alinhamentos e determinar-se quais são estreitamente relacionados de acordo com suas moléculas-alvos. É importante garantir que sequências de organismos não alvos sejam incluídas no planejamento do seu diagnóstico. Se organismos conhecidos como estreitamente relacionados não estão representados nas bases de dados online, essas informações precisarão ser geradas no próprio laboratório. 2. Conter diversidade suficiente para diferenciar todos os alvos. A taxa de evolução/mutação em moléculas não é constante; algumas moléculas evoluem em taxas diferentes. Isto afetará sua escolha, dependendo da resolução necessária. Moléculas que evoluem mais rapidamente serão necessárias para diferenciar

The choice of a molecular target is a crucial stage during diagnostic development, decisions made at this stage will affect all downstream steps and mistakes can lead to significant time loss. Whilst there may not be a perfect molecular target for all applications, an ideal target would share the following characteristics (explanation is given below): 1. Is present in all target organisms and closely related non-target organisms. One aspect of diagnostic development that can easily be overlooked is that closely related non-target organisms should not give false-positive signals or the diagnostic could be invalidated. This undesirable situation can be avoided through thorough analysis of the phylogenetics of the target organism(s), searching online databases for sequences to create alignments and determining which are closely related according to your target molecules. It is important to ensure sequences from non-targets are included when designing your diagnostic. If organisms that are known to be closely related are not represented in online databases then these will need to be generated in-house. 2. Contains sufficient diversity to differentiate all targets. The rate of evolution/mutation in molecules is not universally constant; some molecules evolve at different rates. This will affect your choice of molecule, depending on the resolution needed. Molecules that evolve at faster rates will be needed to differentiate between close-


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organismos próximos e que, portanto, divergiram mais recentemente para garantir suficiente diversidade. Ser suficientemente conservado dentro de espécie/gênero para detectar todas as formas conhecidas de cada alvo. O inverso de (2) é que moléculas que sofrem mutações rápidas podem não ser suficientemente conservadas dentro de espécie/gênero para garantir que o diagnóstico detectará todas as formas da espécie/gênero-alvo. Quando se planejar diagnósticos para menor resolução (ou superior na linhagem taxonômica), uma molécula que sofre mutação mais lenta deve ser o alvo selecionado. Ter comprimento mínimo que satisfaça os itens 2 e 3. Fragmentos curtos amplificados pela PCR apresentam vantagens em relação aos longos, que incluem facilitar a recuperação e amplificação de espécimes subaproveitados, nos quais a degradação do DNA foi inevitável; reduzir os custos com sequenciamento e compatibilidade com tecnologias de sequenciamento alternativas (como chip-based DNA arrays); e melhorar a eficiência de amplificação da PCR que é essencial para as aplicações de qPCR (embora isto possa ser resolvido desenhando-se primers que amplificam uma subseção da molécula selecionada). Ser amplificada por primers de grande amplitude. Os chamados primers universais, que são capazes de amplificar a molécula-alvo selecionada de ampla variedade de organismos, são muito vantajosos durante a fase inicial de desenvolvimento do diagnóstico, especialmente em situações em que há pouca infomação publicada sobre sequências que permitiriam o desenho de primers mais específicos. Eles também permitem a amplificação da molécula-alvo de espécimes desconhecidos. Número de cópias. Enquanto moléculas-alvos que estão presentes em múltiplas có-

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ly-related and therefore more recently divergent organisms to ensure sufficient diversity for differentiation. Is sufficiently conserved within species/genus to detect all known examples of each target. The converse of (2) is that rapidly mutating molecules may not be sufficiently conserved within species/genus to ensure that any diagnostic will detect all examples of the target species/genus. When designing diagnostics for lower resolution (or higher up the taxonomic lineage) then a more slowly-mutating molecular target should be selected. Is the minimum length that will satisfy 2/3. Shorter PCR amplicons have a number of advantages over longer ones. These include ease of recovery and amplification from suboptimal specimens, where DNA degradation may be unavoidable; reduced sequencing costs and suitability for alternative sequence analysis technologies (such as chip-based DNA arrays); and higher PCR amplification efficiency which is essential for qPCR applications (although this can be overcome by designing primers that amplify a sub-section of the selected molecule). Can be amplified by broad-range primers. So-called ‘universal primers’ which are capable of amplifying the chosen target molecule from a wide range of organisms are hugely advantageous during the early stages of diagnostic-development, especially in situations where there is minimal published sequence information that would allow the design of more specific primers. They will also allow the amplification of your target molecule from unknown specimens. Copy number. Whilst molecular targets that are present in multiple cop-

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pias apresentam vantagens em relação a alvos de cópia única, elas também mostram desvantagens. Alvos de múltiplas cópias podem ter uma proporção entre sinal e ruído mais forte, uma vez que quanto maior o número de cópias da molécula-alvo por célula/indivíduo, menores serão os níveis mínimos de presença para detecção. Entretanto, moléculas com múltiplas cópias podem apresentar variação intraindivíduo. A escolha efetiva da molécula-alvo será frequentemente uma escolha pragmática, determinada pela disponibilidade de sequências publicadas em bases de dados públicas, assim como pelos critérios discutidos acima. A escolha principal de molécula-alvo estará entre um gene de cópia única, com frequência um gene funcional, ou uma sequência de múltiplas cópias. Uma série de genes funcionais de cópia única foi usada no desenvolvimento de diagnóstico, mas esses genes tendem a ser específicos para espécie ou gênero. Aqui, nós discutiremos alvos mais genéricos de DNA para o desenvolvimento de diagnóstico.

Estes são tipicamente genes mitocondriais e/ou ribossômicos que apresentam a vantagem de estarem presentes em um número elevado de cópias em cada célula, facilitando a recuperação e amplificação.

Na maioria das células eucarióticas, o DNA mitocondrial (DNAmt) existe como filamento duplo circular, em que a fita interna representa a cadeia leve (cadeia-L, rica em citosina) e a fita externa representa a cadeia pesada (cadeia-H, rica em guanina). Enquanto o DNAmt pode variar consideravelmente em tamanho e complexidade/ conteúdo entre eucariotos, DNAmt de metazoários é tipicamente uma molécula circular, entre 14 – 39 kb, contendo 37 genes (MORITZ et al., 1987). Estes genes caracteristicamente codificam


ies have a number of advantages over single-copy targets they also have disadvantages. Multi-copy targets could have a stronger signal to noise ratio, the more copies of the target per cell/ individual the lower the minimum presence levels for detection will be. However, multi-copy molecules can suffer from intra-individual variation. The actual choice of molecular target will often be a pragmatic choice determined by availability of published sequences on public databases as well as the above criteria. The primary choice of molecular target will be between a single copy gene, often a functional gene, or a multi-copy sequence. A range of single copy, functional genes have been used in diagnostic development but these genes tend to be species or genus specific. Here we will discuss more generic DNA targets for diagnostic development.

These are typically mitochondrial and/ or ribosomal genes which have the advantage of being present in high copy number in each cell, facilitating recovery and amplification.

In most eukaryotic cells, mitochondrial DNA (mtDNA) exists as a circular, double-stranded DNA, where the inner circle represents the light strand (L-strand, the cytosine rich strand) and the outer circle represents the heavy strand (H-strand, the guanine rich strand). Whilst mtDNAs can vary extensively in size and complexity/content between Eukaryotes, Metazoan mtDNAs are typically a circular molecule, between 14 – 39 kb, containing 37 genes (MORITZ et al., 1987). These genes typically encode for 13 proteins (ATPase, atp6 and atp8), cytochrome c oxi-


13 proteínas (ATPase atp6 e atp8), citocromo c oxidase subunidades (cox1–cox3), apocitocromo b (cob), e subunidades da NADH desidrogenase (nad1–6 e nad4L); dois deles codificam RNA ribosômico (RNAr das subunidades pequena e grande; rrnS e rrnL); e 22, RNA transportador (WOLSTENHOLME, 1992). Entretanto, este esquema não é típico para o filo Nematoda que tende a ser mais compacto, variando de 12.6 kb (Xiphinema americanum, HE et al., 2005) a 14.3 kb (Onchocerca volvulus, KEDDIE et al., 1998). Além disso, os genes de proteína, RNAr e RNAt são menores que em outros metazoários ou ausentes. Embora os arranjos de genes no genoma mitocondrial sejam frequentemente semelhantes entre nematoides, eles diferem dos demais metazoários. O genoma mitocondrial de Globodera pallida é atípico, já que é dividido em múltiplas partes, existindo como uma população de moléculas pequenas e circulares ou de diferentes tamanhos (BOORE, 1999). Até o momento, esta característica é única entre os genomas estudados de nematoides. As estruturas secundárias dos RNAt codificados em mitocôndrias e a utilização de códons do DNAmt em nematoides também diferem frequentemente daquelas típicas de metazoários, com genes de proteínas apresentando códon de iniciação atípico (GTT e TTG, raramente o padrão ATG; OKIMOTO et al., 1990). Entre os genes do DNAmt, os dois únicos genes codificantes de proteínas que ocorrem em todos os eucariotos são citocromo c oxidase, subunidade I (COI) e citocromo b. Estas sequências têm sido utilizadas como marcadores filogenéticos em um grande número de organismos para estudos de população, análise de espécie e gênero e como código de barra molecular para identificação de espécies (AVISE et al., 1987; SIMON et al., 1994; HEBERT et al., 2003; AVISE, 2004). DNAmt tem muitas vantagens como marcador: como ocorre em múltiplas cópias por célula, é facilmente amplificado; em geral, é altamente conservado entre animais, com raras duplicações, sem íntrons e regiões intergênicas muito curtas (GISSI et al., 2008); regiões variáveis (por exemplo, regiões de controle) são

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dase subunits (cox1–cox3), apocytochrome b (cob), and NADH dehydrogenase subunits (nad1–6 and nad4L); 2 two ribosomal RNAs (small and large subunit rRNAs; rrnS and rrnL); and 22 for tRNAs (WOLSTENHOLME, 1992). However, this arrangement is not typical for the phylum Nematoda which tend to be far more compact, ranging from 12.6 kb ( Xiphinema americanum, HE et al., 2005) to 14.3 kb (Onchocerca volvulus, KEDDIE et al., 1998). Additionally, protein, rRNA and tRNA genes are smaller than in other metazoans or missing. Whilst gene arrangements between nematode mt-genomes are often similar, they differ from that seen in other metazoans. The mt-genome of Globodera pallida is highly unusual in that it is multipartite, existing as a population of small, circular DNAs or differing sizes (BOORE, 1999). To date, this is unique among studied nematode genomes. Differences in the secondary structures of mitochondrial-encoded tRNAs as seen in nematodes (compared to other metazoans) and codon usage in nematode mtDNA is also often different to that of typical metazoans with protein genes often initiating at unusual start codons (GTT and TTG, rarely the standard ATG; OKIMOTO et al., 1990). Among mtDNA genes the only 2 protein-coding genes that occur in all eukaryotes are cytochrome c oxidase, subunit I (COI) and cytochrome b. These sequences have been used as phylogenetic markers in a wide range of organism for population studies, species and genus analysis and as molecular barcodes for species identification (AVISE et al., 1987; SIMON et al., 1994; HEBERT et al., 2003; AVISE, 2004). MtDNA has many advantages as a marker. As mtDNA occurs in multiple copies per cell it is easily amplified, in general it is strongly conserved across animals, with very few duplications, no introns and very short intergenic regions (GISSI et al., 2008) and variable regions (e.g. the control regions) are typically flanked by highly conserved re-

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normalmente ladeadas por regiões altamente conservadas (regiões funcionais), permitindo o desenho de primers de PCR que deverão amplificar entre espécies (GISSI et al., 2008). Aparentemente, DNAmt parece ser o alvo ideal para estudos filogenéticos e para o desenvolvimento de diagnóstico e foi usado em um grande número de estudos, incluindo filogenética de nematoides (DERYCKE et al., 2010). Entretanto, quando são usadas sequências de DNAmt para esse tipo de estudo, pressuposições são feitas sobre os processos envolvidos na herança, conservação e evolução do DNAmt. Uma pressuposição é que o DNAmt tem herança uniparental (SONG et al., 2014), pelas células germinativas maternas, e está associado à segregação vegetativa que remove a heteroplasmia (a presença de mais de um tipo de DNAmt) com alta eficiência. Isto conduz a pressuposição de que os indivíduos são homoplásticos (BIRKY, 2001). Homoplasmia exclui a recombinação entre sequências heterólogas e assim a pressuposição subsequente é que DNAmt efetivamente não é recombinante. Esta segunda hipótese significaria que qualquer mudança que ocorrer no DNAmt deve vir por mutação, que seria então herdada de maneira clonal pela linha maternal. Uma outra pressuposição, ligada à segunda, é que a taxa de evolução do DNAmt deve ser precisa. Se o DNAmt está envolvido em funções metabólicas básicas (como a respiração), então os genes codificados nas mitocôndrias são considerados menos propensos a serem implicados em processos adaptativos. Portanto, na ausência de mutações difundidas por processos de seleção positiva, somente mutações neutras (ou ligeiramente negativas) devem se acumular ao longo do tempo, indicando que os níveis de divergência do DNAmt devem refletir tempos de divergência entre organismos (GALTIER et al., 2009). Isto significa que a análise de DNAmt tem sido fundamental para responder questões nas áreas de ecologia e biologia evolutiva (AVISE et al., 1987), genética da conservação (ROBERTSON et al., 2007), entre outras. Entretanto, os estudos recentes têm lançado dúvidas sobre as pressuposições discutidas aci-


gions (functional regions) allowing the design of PCR primers which should amplify across species (GISSI et al., 2008). On the face of it, mtDNA appears to be an ideal target for phylogenetic studies and diagnostic development and has been used in a large number of studies, including nematode phylogenetics (DERYCKE et al., 2010). However, when using mtDNA sequences for this type of study, assumptions are made about the underlying processes involved in inheritance, conservation and evolution of the mtDNA. One assumption is that mtDNA is inherited uniparentally (SONG et al., 2014) through the maternal germline and is associated with vegetative segregation which removes heteroplasmy (the presence of more than one type of mtDNA) with high efficiency. This leads to the assumption that individuals are homoplasmic (BIRKY, 2001). Homoplasmy precludes recombination between heterologous sequences and so a further assumption was that mtDNA was effectively non-recombining. This second assumption would mean that any changes that occur in mtDNA must come about through mutation which would then be inherited clonally down the maternal line. A further assumption, linked to the second, is that the evolution rate of mtDNA must be clock-like. If the mtDNA is involved in basic metabolic functions (respiration) then mt-encoded genes are considered less-likely to be involved in adaptive processes. Therefore, in the absence of mutations spreading through positive-selection processes, only neutral (or only slightly negative) mutations should accumulate over time meaning that mtDNA divergence levels should reflect divergence times between organisms (GALTIER et al., 2009). This has meant that mtDNA analysis has been instrumental in answering questions in areas of ecology and evolutionary biology (AVISE et al., 1987) and conservation genetics (ROBERTSON et al., 2007) amongst others.


ma, indicando a presença de variações intraindividuais em sequências de DNAmt (BENSASSON et al., 2000; SWORD et al., 2007; BUHAY 2009). Enquanto o mecanismo específico responsável por isso é complexo e está além do escopo deste capítulo, é reconhecido agora que indivíduos podem ser heteroplásmicos, carregando mais que um único genoma mitocondrial (WHITE et al., 2008), o que pode complicar a tarefa de diagnóstico para um único indivíduo e haplótipos mitocondriais ortólogos. Certamente não tão comuns como os genomas mitocondriais homoplásmicos, esses genomas heteroplásmicos podem acontecer pela eliminação incompleta de variantes mutantes em uma célula, subsequente recombinação heteróloga, transmissão de DNAmt paterno ou eventos de hibridização (WHITE et al., 2008) e devem ser considerados quando se usar DNAmt como marcador molecular para estudos filogenéticos ou para o posterior desenvolvimento de diagnóstico. Uma consideração adicional, com relação ao uso de DNAmt como marcador filogenético/ferramenta de diagnóstico, é a presença de sequências de DNA nuclear de origem mitocondrial (NUMTs). NUMTs são consequência da incorporação de uma Į- protobactéria em uma célula eucariótica maior durante a evolução do que se tornaria uma organela mitocondrial (LOPEZ et al., 1994; EMELYANOV, 2001). Então, para manter a função durante este processo, em teoria ao menos duas cópias funcionais dos mesmos genes da Į- protobactéria estariam presentes tanto no núcleo quanto na organela em evolução (WOLFF et al., 2012). Estes NUMTs são normalmente não funcionais, mas em nível de espécie apresenta alta homologia com seus equivalentes mitocondriais e variam em comprimento de poucos nucleotídeos a cópias integrais do genoma mitocondrial (MOURIER et al,, 2001). NUMTs tem a possibilidade de afetar seriamente análises filogenéticas já que elas podem confundir a pressuposição básica de que sequências ortólogas estão sendo comparadas (WILLIAMS e KNOWLTON 2001; SONG et al., 2008; ERPENBECK et al., 2011). Sendo não funcionais, elas provavelmente evoluiriam a uma

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However, recent studies have cast some doubt on the above assumptions by indicating the presence of intra-individual variations in mtDNA sequences (BENSASSON et al., 2000; SWORD et al., 2007; BUHAY 2009). Whilst the exact mechanisms leading to it is complex and outside the scope of this article, it is now recognised that individuals can be heteroplasmic, carrying more than one unique mitochondrial genome (WHITE et al., 2008) which can complicate the assignment of a single individually diagnostic and orthologous mtDNA haplotype. Whilst certainly not as common as homoplasmic mt-genomes, these heteroplasmic mt-genomes may come about through incomplete elimination of mutant mitochondrial variants within a cell, subsequent heterologous recombination, paternal mtDNA transmission or even hybridization events (WHITE et al., 2008) and must be considered when using mtDNA as a molecular marker for phylogenetic studies or for down-stream, diagnostic development. One additional consideration regarding the use of mtDNA as a phylogenetic marker/ diagnostic tool is the presence of Nuclear-encoded mitochrondrial pseudogenes (NUMTs). NUMTs are a consequence of the incorporation of an Į- protobacterium into a larger eukaryotic cell during the evolution of what would become the mitochondrial organelle (LOPEZ et al., 1994; EMELYANOV 2001). Thus, to maintain function during this process, in theory at least two functional copies of some Į-protobacterium genes would be present in both the nucleus and evolving organelle (WOLFF et al., 2012). These NUMTs are generally non-functional but at species level have high homology to their mitochondrial counterparts and range in length from a few nucleotides to entire copies of the mitochondrial genome (MOURIER et al. 2001). NUMTs have the potential to severely affect phylogenetic analyses as they confound the basic assumption that orthologous sequences are

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taxa mais alta; consequentemente mutações acumulariam em razão da falta de restrições evolutivas (SONG et al., 2008; BUHAY, 2009). Esta falta de restrições evolutivas poderia explicar uma das particularidades características das NUMTs; elas geralmente contêm um grande número de códons de parada. Embora NUMTs sejam não funcionais, elas podem oferecer uma fonte adicional de informação genética aplicável para encontrar relações evolutivas (WOLFF et al., 2012; WILLIAMS e KNOWLTON, 2001). Estudos recentes, entretanto, mostraram que em mamíferos, poríferos e crustáceos há evidência de mais do que um simples evento de transferência do genoma mitocondrial para o núcleo, o que pode dificultar qualquer filogenia baseada nestas sequências (FUKUDA et al., 1985; WILLIAMS e KNOWLTON 2001; SONG et al., 2008; ERPENBECK et al., 2011). Desde que ZISCHLER (2000) inicialmente propôs o uso de NUMTs como marcadores filogenéticos, elas têm sido usadas em diversos estudos em uma série de organismos, de primatas (HAZKANI-COVO et al., 2010; KARANTH, 2008) a camarões (BAEZA e FUENTES, 2013) e poderiam formar a base de diagnóstico molecular.

O arranjo dos genes que codificam o RNA ribossômico de um genoma eucarionte típico é mostrado na Figura 1. Ele consiste em várias cópias repetidas em tandem de uma unidade de transcrição (que codifica o RNA ribosomômico para formar a estrutura do ribossomo) e o espaçador não transcrito (NTS, do inglês non-transcribed spacer, frequentemente chamado de espaçador intergênico, IGS, do inglês Intergenic Spacer), e o exato número de cópias pode variar de uma a milhares (HILLIS e DIXON, 1991; POWERS, 2004). Os genes do RNAr são os mais abundantes e importantes genes housekeeping na célula, sendo altamente conservados de bactérias a humanos (KOBAYASHI, 2011).


being compared (WILLIAMS and KNOWLTON 2001; SONG et al., 2008; ERPENBECK et al., 2011). Being non-functional they would likely evolve at a higher rate; hence mutations will accumulate due to a lack of evolutionary constraints (SONG et al., 2008; BUHAY, 2009). This lack of evolutionary constraints could explain one of the characteristic features of NUMTs; they typically contain a large number of stop codons. Whilst NUMTs are non-functional they can offer an additional source of genetic information employable to trace evolutionary relationships (WOLFF et al., 2012; WILLIAMS and KNOWLTON 2001). Recent studies, however, have shown that in mammals, sponges and crustaceans there is evidence of more than a single transfer event from the mitochondrial genome to the nucleus which could complicate any phylogeny based on numts (FUKUDA et al., 1985; WILLIAMS and KNOWLTON 2001; SONG et al., 2008; ERPENBECK et al., 2011). Since ZISCHLER (2000) first proposed the use of NUMTs as phylogenetic markers they have been used in a number of studies on a range of organisms from primates (HAZKANI-COVO et al., 2010; KARANTH, 2008) to shrimps (BAEZA and FUENTES, 2013) and could form the basis of molecular diagnostics.

The ribosomal array of a typical eukaryote nuclear genome is shown in Figure 1. The array typically consists of several tandemly repeated copies of the transcription unit (which encode ribosomal RNAs which form the skeletal framework of the ribosome) and the non-transcribed spacer (NTS, often called the Intergenic Spacer, or IGS), although the exact number of copies can vary from one to several thousand (HILLIS and DIXON 1991; POWERS 2004). The rRNA genes are the most abundant and essential housekeeping genes in the cell, and are highly conserved from bacteria to humans (KOBAYASHI, 2011).


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Os genes que codificam o RNA ribossômico e suas sequências intercalares são provavelmente os genes melhor caracterizados em Nematoda (POWERS, 2004). Uma das razões que fazem o DNAr útil para análise filogenética e para o desenvolvimento de diagnóstico é que diferentes regiões da unidade de repetição do DNAr evoluem a diferentes taxas. Além disso, há ilhas de sequências altamente conservadas dentro da maioria desses genes, o que os torna alvos ideais para primers universais, permitindo a amplificação de diferentes espécies com um único conjunto de primers de PCR. Historicamente, a subunidade menor do ribossomo (SSU) tem o RNAr mais estudado (HILLIS e DIXON, 1991), porque está entre as sequências-alvos que evoluem mais lentamente, sendo encontrada em todos organismos vivos e foi útil para esclarecer eventos evolucionários antigos. É importante também para determinar relações entre organismos mais distantes, comumente relações entre-gêneros. Esta baixa taxa de evolução também tem permitido o desenho de diversos primers universais que amplificarão quase todos os alvos. O gene de RNAr da subunidade ribossômica maior (LSU) apresenta um número de diferentes domínios que evoluem em taxas diferentes. Estão incluídos muitos domínios divergentes ou segmentos de expansão (HASSOUNA et al., 1984) que podem causar variações no compri-

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The ribosomal RNA genes and their intervening sequences are probably the best characterised genes or gene-regions in Nematoda (POWERS, 2004). One of the reasons that rDNA is useful for phylogenetic analysis and for diagnostic design is that different regions of the rDNA repeat unit evolve at different rates. Additionally, there are islands of highly conserved sequences within most rRNA genes which are ideal targets for “universal” primers, allowing amplification from many different species with a single PCR primer set. Historically the small sub-unit (SSU) was the most studied rRNA (HILLIS and DIXON, 1991) because it is amongst the most slowly evolving sequence target found throughout living organisms and was therefore useful for elucidating ancient evolutionary events and is useful for determining relationships between more distantly related organisms, typically inter-genus relationships. This slow rate of evolution has also allowed the design of several ‘universal primer’ sets that will amplify from nearly all targets. The large subunit rRNA gene has a number of different domains which evolve at different rates. These include many divergent domains or expansion segments (HASSOUNA et al., 1984) which can cause length variations within the LSU as well as sequence vari-

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mento dentro da subunidade e variação na sequência dentro dessas regiões de expansão. A região de expansão mais comumente estudada é a D2-D3, que é muito útil para reconstrução de eventos evolutivos mais recentes ou para determinar relações (e, assim, o desenvolvimento de diagnóstico) entre organismos próximos, caracteristicamente relações interespecíficas. Os genes de RNAr 5.8S em eucariontes (e a região correspondente da maior subunidade em procariontes) têm uma taxa evolutiva similar à da subunidade menor, mas seu menor comprimento limita a utilidade para a determinação de relações filogenéticas ao longo de períodos prolongados de tempo (NAZAR et al., 1976). As regiões espaçadoras são frequentemente usadas para analisar filogenias entre organismos próximos, interespecíficos ou mesmo entre subespécies e é um alvo comum no desenvolvimento de diagnóstico. As regiões ITS (ITS1 e ITS2) são mais conservadas que a NTS/IGS, que é a região que evolue mais rapidamente entre todas as regiões de RNAr. As regiões ITS são frequentemente um alvo atrativo para análise como primers universais, ancorados nas regiões terminais, conservadas da subunidade menor, 5.8S e a subunidade maior pode facilmente permitir a amplificação por PCR das regiões ITS completas. A desvantagem do uso das regiões ITS como alvo para desenvolvimento de diagnóstico é a presença de múltiplos tipos de ITS, algumas vezes encontrados dentro de espécies ou mesmo entre indivíduos. Variabilidade intraespecífica em ITS foi relatada em uma série de táxons, incluindo crustáceos, nematoides e platelmintos (CARRANZA et al., 1999; GANDOLFI et al., 2001; KRÁLOVÁ-HROMADOVÁ et al., 2010; CARDOSO et al., 2011). Diversas explicações foram propostas para a heterogeneidade intraespecífica observada na região ITS1. Sugeriu-se que conjuntos de operons ribossomais ocorrem em mais de um cromossomo (VAN HERWERDEN et al., 2000) e a evolução pode não ter resultado em sequências homogeneizadas ou que eventos de hibridização recentes permitiram a presença de sequências apa-


ation within these expansion regions. The most commonly studied of these is the D2-D3 expansion region which is highly useful for reconstructing more recent (evolutionarily speaking), events or for determining relationships (and therefore designing diagnostics) between closely related organisms, typically inter-species relationships. The 5.8S rRNA genes in eukaryotes (and the corresponding region of the large sub-unit in prokaryotes) have an evolutionary rate similar to that of the small sub-unit but, unfortunately, its short length makes it of limited usefulness for inferring phylogenetic relationships across extended timescales (NAZAR et al., 1976). The spacer regions are often used to analyse phylogenies between closely related organisms, inter-species or even inter-sub-species and is a common target for diagnostic development. The ITS regions (ITS1 and ITS2) are more conserved than the NTS/IGS which is the most rapidly evolving of all the rRNA regions. The ITS regions are often an attractive target for analysis as universal primers, anchored in the conserved, terminal regions of the SSU, 5.8S and the LSU can easily allow PCR amplification of the whole ITS regions. One disadvantage of using the ITS regions as a target for diagnosis development is the presence of multiple ITS types sometimes found within species or even within individuals. Intraspecific ITS variability has been reported for a number of taxa including cestode, crustaceans, nematodes and flatworms (CARRANZA et al., 1999; GANDOLFI et al., 2001; KRÁLOVÁ-HROMADOVÁ et al., 2010; CARDOSO et al., 2011). Several explanations have been proposed for the intra-specific heterogeneity observed in ITS1. It has been suggested that arrays of rRNA operons occur on more than one chromosome (VAN HERWERDEN et al., 2000) and evolution may not have resulted in homogenised sequences or that recent hybridisation events have allowed the presence of sequences apparently from different phylogenetic clusters


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rentemente de diferentes grupos filogenéticos dentro de um único isolado. Estas variantes intraespecíficas/intraindivíduos de ITS podem diminuir consideravelmente a especificidade ou sensibilidade de qualquer diagnóstico e deve-se tomar cuidado para garantir que a variante de ITS mais frequente seja o alvo e que essa variante não esteja presente em espécies não alvos.

within a single isolate. These intra-species/ individual ITS variants can seriously detract from the specificity or sensitivity of any diagnostic and care must be taken to ensure that any diagnostic is targeted at the most common ITS-variant and to ensure that no ‘non-target’ species harbour this ITS variant, even at low levels.

Desde sua invenção no final dos anos 1980 (MULLIS et al., 1986; SAIKI et al., 1988), a reação em cadeia da polimerase (PCR) teve um impacto enorme na área de diagnósticos e este método robusto e confiável para amplificar (in vitro), com auxílio de enzimas, fragmentos de DNA permitiu o desenvolvimento de uma ampla série de diagnósticos moleculares. Alguns deles são discutidos abaixo.

Since its invention in the late 1980’s (MULLIS et al., 1986; SAIKI et al., 1988), the polymerase chain reaction (PCR) has had huge impact on the field of diagnostics and this robust and reliable method for enzymatically amplifying (in vitro) sections of DNA has allowed the development of a wide range of molecular diagnostics. Some of these are discussed below.

3&5HVSHFt¿FD Dada informação suficiente em relação à sequência de um determinado gene ou região gênica da sua espécie-alvo, é possível desenhar primers de PCR que amplificarão somente do organismo-alvo. Este método foi usado para uma série de organismos (POWERS e HARRIS, 1993; ORUI, 1996; AL-BANNA et al., 2004; SAEKI et al., 2013). Desenhado corretamente, PCR específica apresenta vantagens: é altamente específica, não exige manipulação dos produtos de PCR além da separação por gel de eletroforese, permite a combinção de diferentes primers para detecção simultânea de diversos alvos (com modificações adequadas para produzir produto de PCR de diferente tamanho para cada espécie-alvo). A combinação de primers específicos de PCR marcados com fluoróforos (de diferentes comprimentos de onda) e um transiluminador equipado com diferentes filtros pode permitir a detecção simultânea de vários produtos de PCR de tamanhos similares. As desvantagens dessa abordagem são que primers específicos devem

6SHFL¿F3&5 Given sufficient information regarding the sequence of a chosen gene or gene-region for your target species it is possible to design PCR primers that will amplify only from the target organism. This approach has been used for a number of organisms (POWERS and HARRIS, 1993; ORUI, 1996; AL-BANNA et al., 2004; SAEKI et al., 2013). Correctly designed, specific PCR has a number of advantages: highly specific, requires no post-PCR manipulation of PCR products other than separation by gel electrophoresis, can be multiplexed to allow simultaneous detection of several targets (with suitable design modifications to produce PCR products of different sizes for each target species). Combining specific-PCR primers labelled with fluorophores (of different wavelengths) with a transilluminator fitted with different filters can allow simultaneous detection of several PCR products of similar size. The disadvantages of this approach are that specific primers

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ser desenhados para cada alvo e deve-se tomar muito cuidado para que qualquer variação intraespecífica seja abrangida pelos primers e, dessa maneira, evitar qualquer reação cruzada com organismos não alvos. Ademais, esse enfoque é unicamente qualitativo e não quantitativo e foi, dessa maneira, sucedido pelo método de qPCR.

6HSDUDomRSHOR FRPSULPHQWRGDUHJLmR,76 Uma das maneiras mais simples para desenvolvimento de diagnóstico é tirar proveito da heterogeneidade do comprimento encontrado frequentemente dentro das regiões ITS de muitos organismos. Este enfoque depende do uso de primers universais que amplificarão todos os organismos-alvos, seguido da separação dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose, se suficiente variação do comprimento estiver presente entre espécies (POWERS et al., 1997). A vantagem dessa abordagem é que, se a heterogeneidade presente for satisfatória, diversos alvos (espécies ou gêneros de nematoides) podem ser detectados simultaneamente. Essa técnica funciona bem para muitos nematoides, mas o nível de resolução permitido por eletroforese em gel pode tornar a identificação problemática, especialmente em situações em que múltiplos tipos de nematoides estão presentes. O problema é frequentemente acentuado em situações em que espécies próximas de nematoides estão presentes e essa abordagem poderá falhar na separação. O método também é muito demorado e de difícil aplicação simultânea para número elevado de amostras. Esse método simplista foi em grande parte substituído por técnicas como Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD) e polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição (PCR-RFLP).

Esta metodologia depende da combinação do uso de primers universais de PCR para amplificar um gene/região gênica de todos os orga-

must be designed for each target; great care must be taken to ensure that any intra-species variation is covered by the primers and to avoid any cross-reaction with non-target organisms. Additionally, this approach is purely qualitative and not quantitative. This approach forms the basis of, and has been largely superseded by, qPCR assays.

One of the simplest approaches for diagnostic development is to take advantage of the length heterogeneity often found within the ITS regions of many organisms. This approach relies on the use of ‘universal primers’ that will amplify all target organisms followed by separation of the PCR products by agarose gel electrophoresis, if sufficient length variation is present between species (POWERS et al., 1997). The advantage of this approach is that, if sufficient length heterogeneity is present, several targets (nematode species or genera) can be ‘detected’ simultaneously. This approach works well in many nematodes but the level of resolution possible by gel electrophoresis can make reliable identification problematic, especially in situations where multiple nematode types are present. This is often exacerbated in situations where many closely related nematode species are present and this approach will often fail to separate such closely related targets. The approach is also highly time consuming and difficult to use on large numbers of samples simultaneously. This simplistic approach was largely superseded by techniques such as Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and PCR-RFLP.

This approach relies on a combination of universal PCR primers to amplify a gene/ gene-region from all target organisms combined with the use of restriction endonucleases to digest or cleave the PCR products


nismos-alvos, seguido da digestão ou clivagem dos produtos de PCR por endonucleases de restrição (Figura 2). O exame cuidadoso do gene/ região gênica (normalmente a ITS-1) para todos os organismos-alvos (e organismos não alvos próximos) pode identificar sítios de restrição que produzirão fragmentos de restrição espécie-específico que poderão ser utilizados no diagnóstico dos organismos-alvos (HOYER et al., 1998; IWAHORI et al., 1998; KANZAKI e FUTAI, 2003; SKANTAR et al., 2007; BURGERMEISTER et al., 2009; ǅIRCA et al., 2010). A vantagem é que estende o conceito básico de separação pelo comprimento discutido anteriormente e permite a separação de organismos que podem ter o mesmo comprimento de produto de PCR, mas apresentam polimorfismos da sequência que adicioanaram ou removeram um sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição. A desvantagem é que, embora seja possível predizer os tamanhos dos fragmentos para organismos-alvos, qualquer organismo não alvo pode ser também amplificado e digerido por endonucleases de restrição, produzindo tanto fragmentos de tamanhos similares aos de um organismo-alvo (um resultado falso-positivo) quanto fragmentos de tamanhos imprevistos, o que dificultaria a análise.

297

(Figure 2). Careful examination of the gene/ gene-region (typically the ITS-1) for all target organisms (and closely related non-target organisms) can identify restriction sites which will produce species-specific restriction fragments that can be diagnostic for the target organisms (HOYER et al., 1998; IWAHORI et al., 1998; KANZAKI and FUTAI 2003; SKANTAR et al., 2007; BURGERMEISTER et al., 2009; ǅIRCA et al., 2010). The advantage of this approach is that it extends the basic concept of the length separation approach above and can allow separation of organisms that may have the same length PCR product but have sequence polymorphisms which have added or removed a restriction endonuclease recognition site. The disadvantage of this approach is that, whilst it is possible to predict the expected fragment sizes for target organisms, any non-target organisms present may also be amplified and digested by the restriction endonucleases to either produce fragments of similar size to a target organism (a false-positive result) or to produce fragments of unexpected sizes which which confounds analysis.

298


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75)/3 Polimorfismo no comprimento de fragmentos terminais de restrição (T-RFLP) foram amplamente usados em ecologia microbiana para diferenciação de comunidades (LIU et al., 1997; MOESENEDER et al., 1999) e para comparação de riqueza fenotípica e estrutura de comunidades (LAMONTAGNE et al., 2003). Amplificação com primers fluorescentes é seguida por digestão com enzimas de restrição para produzir fragmentos terminais de restrição (T-RFs) marcados, que são separados por eletroforese

Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) has been widely used in microbial ecology for differentiation of communities (LIU et al., 1997; MOESENEDER et al., 1999) and for comparison of relative phenotype richness and structure of communities (LAMONTAGNE et al., 2003). Amplification with fluorescent primers is followed by digestion with restriction enzymes to produce labelled Terminal-Restriction Fragments (T-RFs) which are separated by


capilar de alta resolução em sequenciadores automáticos de DNA, usando padrões internos de tamanho (AVANISS-AGHAJANI et al., 1994). O padrão de T-RFLP para uma amostra pode ser convertido em forma numérica e comparado entre amostras usando uma série de métodos estatísticos (KENT et al., 2003; OSBORNE et al., 2006) (Figura 3). A extensão lógica é o uso da análise de T-RFLP para identificar organismos específicos em uma comunidade, pela associação de T-RFs das corridas experimentais com T-RFs preditos a partir de sequências existentes em bases de dados (BRAKER et al., 2001; KAPLAN e KITTS, 2003), um processo que exige validação rigorosa. Este método é frequentemente chamado de DT-RFLP (‘T-RFLP Dirigido’) já que o desenho dos primers de PCR e a seleção de enzimas de restrição são cuidadosamente direcionados para permitir a identificação de T-RFs de diagnóstico da espécie-alvo ou grupos dentro de amostras. Este enfoque foi utilizado com sucesso para o estudo de comunidades de nematoides (DONN et al., 2012; GEORGE e LINDO, 2015). A vantagem do método é que ele é semiquantitativo, indicando a abundância relativa de muitas espécies-alvos dentro da estrutura da comunidade da amostra ou ele pode ser usado em conjunto com um método quantitativo (por exemplo, qPCR) para possibilitar a análise quantitativa completa. Esta técnica apresenta a desvantagem de exigir grande disponibilidade de informação das sequências de todos os organismos-alvos e também não alvos para planejar o protocolo de restrição, o que pode ser auxiliado por ferramentas tais como DRAT (ROBERTS et al., 2012b). Além disso, qualquer sinal imprevisto exige análise adicional, normalmente por métodos de sequenciamento de DNA.

299

high resolution capillary electrophoresis on automated DNA sequencers using internal size standards (AVANISS-AGHAJANI et al., 1994). The patterns of T-RFLP for a sample can be converted into numerical form and compared between samples using a variety of statistical approaches (KENT et al., 2003; OSBORNE et al., 2006) (Figure 3). A logical extension is the use of T-RFLP analysis to identify specific organisms in a community by associating T-RFs from experimental runs with predicted T-RFs from a database of existing sequences (BRAKER et al., 2001; KAPLAN and KITTS, 2003), a process that requires careful validation. This is often referred as DT-RFLP (‘Directed T-RFLP’) as the design of the PCR primers and selection of restriction enzyme is carefully ‘directed’ to allow identification of diagnostic T-RFs for specific target species or groups within samples. This approach has been successfully used to diagnose nematode communities (DONN et al., 2012; GEORGE and LINDO, 2015). The advantage of this approach is that it is semi-quantitative, in that it indicates the relative abundance of many target species within the community structure of the sample or it can be used in conjunction with a quantitative (e.g. qPCR) step to allow fully quantitative analysis. The disadvantages of this technique are that it requires extensive sequence information on all target and closely-related, non-target organisms for the design of the restriction protocol, which can be aided by using design tools such as DRAT (ROBERTS et al., 2012b). Additionally, any unexpected signals require further analysis, typically via DNA sequencing approaches.

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qPCR é uma variação da PCR convencional que, embora mais dispendiosa, tem as vantagens de rapidez, sensibilidade e a habilidade de quantificar alvos. qPCR possibilita a detecção e quantificação de quantidades muito reduzidas de DNA em diversos extratos. Basea-se em dois princípios. Primeiro, Taq-DNA polimerase apresenta atividade exonuclease 5’ → 3’ que cliva qualquer sonda ligada ao molde que encontra. Segundo, sondas de oligonucleotídeos marcadas duplamente com um fluoróforo repórter em uma extremidade, normalmente FAM (6-carboxifluoresceína), e um fluoróforo quencher na outra extremidade, como TAMRA (6-tetrametilcarboxirrodamina), somente emitirão sinal quando clivadas, com base no princípio de transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET) (CARDULLO et al., 1998). Enquanto a sonda está intacta, a transferência de energia de fluorescência ocorre e as emissões do flouróforo repórter são absorvidas pelo fluoróforo quencher. Quando a sonda é clivada (durante a fase de extensão da PCR), os fluoróforos são separados e as emissões do repórter não são mais transferidas para o quencher e po-

qPCR is a variation of standard PCR which, although more expensive than conventional PCR, has the advantages of speed, sensitivity, and the ability to quantify targets. qPCR allows the detection and quantification of very low amounts of DNA in diverse extracts. It is based on two primary principles. Firstly; TaqDNA polymerase has 5’ → 3’ exonuclease activity which cleaves any probe bound to the template it encounters. Secondly; dual-labelled oligonucleotide probes with a reporter dye, typically FAM (6-carboxyfluorescin), at one end and a quencher dye, e.g. TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine) at the other will only emit a signal when cleaved, based on the fluorescence resonance energy transfer (FRET) principle (CARDULLO et al., 1998). As long as the probe is intact, fluorescence energy transfer occurs and the emissions of the fluorescent reporter dye is absorbed by the quenching dye. When the probe is cleaved (during the extension phase of the PCR) the reporter and quencher dyes are separated and the reporter dye emissions are no longer transferred by the


dem ser detectadas. Este processo não impede a PCR e o sinal do fluoróforo repórter é detectado em tempo real durante todo o ciclo de PCR (Figura 4). O aumento no sinal do fluoróforo repórter pode ser diretamente correlacionado ao número inicial de cópias do molde de DNA, comparando-se a padrões de número conhecido de cópias. Plataformas de qPCR são baseadas normalmente em placas de 96 poços que permitem a análise de 80 ou mais amostras simultaneamente (deixando espaço para os padrões internos). qPCR é superior ao PCR convencional em termos de especificidade e habilidade para usar sondas TaqMan em análises multiplex, que podem avaliar múltiplos patógenos simultaneamente (SAYLER, 2012).

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quencher dye and can be detected. This process does not impede the PCR and the fluorescent reporter signal is detected in ‘real-time’ every cycle of the PCR (see Figure 4). The increase in reporter dye signal can be directly correlated to the initial copy number of the DNA template by comparing to standards of known copy number. qPCR platforms are typically based on the 96-well plate platform which allows the analysis of (typically) 80+ samples (leaving room for internal standards). qPCR is superior to conventional PCR in terms of specificity and the ability to use TaqMan probes to develop multiplex assays that can screen for multiple pathogens at one time (SAYLER, 2012).

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qPCR tornou-se rapidamente o sistema preferido de diagnóstico e protocolos foram relatados para muitos nematoides parasitos de plantas, incluindo Xiphinema (BERRY et al., 2007; VAN GHELDER et al., 2015), Pratylenchus (YAN et al., 2013), Meloidogyne (SAEKI et al., 2013; QIU et al., 2006; BERRY et al., 2008; Bursaphelenchus (FRANCOIS et al., 2007; LEAL et al., 2007) e Globodera (TOYOTA et al., 2008; NOWACZYK et al., 2008; NAKHLA et al., 2010). Como o custo de equipamentos e reagentes decresce continuamente, a principal desvantagem (alto custo) da qPCR está deixando de ser um impecilho.

Muitos diagnósticos moleculares baseados em DNA foram desenvolvidos para aplicação em nematologia (veja revisões de JONES et al., 1997; POWERS et al., 1997; POWERS, 2004; BLOK, 2005; OLIVEIRA et al., 2011) que são rotineiros, rápidos e robustos. A reação em cadeia da polimerase (PCR) revolucionou os estudos de NPP e, na última década, um fluxo constante de publicações demostrou sua utilidade em uma ampla série de aplicações, incluindo estudos filogenéticos, melhoramento genético para resistência, descoberta de novos genes de patogenicidade, adquiridos por transferência horizontal, e no desenvolvimento de diagnósticos moleculares. Diagnósticos moleculares estão evoluindo. Diagnósticos moleculares baseados em PCR oferecem sensibilidade, precisão e confiabilidade quando usados para complementar informação descritiva tradicional. A demonstração de que um método baseado em PCR poderia amplificar regiões polimórficas, que diferenciavam espécies próximas de nematoides, foi uma grande conquista (POWERS e HARRIS, 1993) e muitos relatos posteriores corroboraram esta regra para espécies irmãs. A sensibilidade de detec-


qPCR has rapidly become a diagnostic platform of choice and diagnostic assays have been reported for many plant pathogenic nematodes including Xiphinema (BERRY et al., 2007; VAN GHELDER et al., 2015), Pratylenchus (YAN et al., 2013), Meloidogyne (SAEKI et al., 2013; QIU et al., 2006; BERRY et al., 2008; Bursaphelenchus (FRANCOIS et al., 2007; LEAL et al., 2007) and Globodera (TOYOTA et al., 2008; NOWACZYK et al., 2008; NAKHLA et al., 2010). As the cost of equipment and reagents decreases, the main disadvantage of qPCR (cost) has becomes less of an impediment.

Many DNA based molecular diagnostics have been developed for application in nematology (see reviews by JONES et al., 1997; POWERS et al., 1997; POWERS, 2004; BLOK, 2005; OLIVEIRA et al., 2011) which are routine, rapid and robust. The polymerase chain reaction (PCR) has revolutionised studies of PPN and in the past decade, a steady flow of publications has demonstrated its use in a wide range of applications including phylogenetic studies, molecular breeding for resistance, discovery of novel pathogenicity genes acquired by horizontal gene transfer as well as in the development of molecular diagnostics. Molecular diagnostics are evolving. PCRbased molecular diagnostics have demonstrated that they offer sensitivity, accuracy and confidence when used to complement “conventional” descriptive information. The demonstration that a PCR-based method could amplify polymorphic regions that distinguished closely related species of nematodes was a major achievement (POWERS and HARRIS, 1993) and many subsequent reports have followed that have validated


ção de uma espécie específica, dentro de uma mistura com outros nematoides, é também um importante avanço demonstrado inicialmente usando misturas controladas de DNA purificado e, posteriormente, validado com a detecção de um único indivíduo dentro de uma mistura complexa de nematoides de uma comunidade do solo (SUBBOTIN, et al., 2001; HÜBSCHEN et al., 2004a). Atualmente, diversos ensaios de qPCR foram desenvolvidos que, podendo ser usados para quantificar diferentes espécies em misturas. Amplificação de genes de poucas cópias ou de cópia única é também possível pela sensibilidade da PCR, dada à natureza multicelular dos nematoides, e, embora esse nível de sensibilidade seja tecnicamente desafiador, oferece o potencial de diferenciar isolados com diferenças biológicas, tais como virulência ou avirulência a um gene específico de resistência. Outros aprimoramentos técnicos em equipamentos, reagentes melhores e mais acessíveis, novas tecnologias de qPCR e robótica continuarão a transformar a função do diagnóstico molecular na nematologia no futuro. Considerando a importância econômica mundial, a maioria dos diagnósticos moleculares iniciais concentrou-se principalmente em Meloidogyne, Heterodera, Pratylenchus e Globodera (por exemplo, ZIJLSTRA et al., 1995; SHIELDS et al., 1996; UEHARA et al., 1998; SUBBOTIN et al., 1999, 2000), e também poucos foram direcionados para espécies de longidorídeos (HÜBSCHEN et al., 2004b; OLIVEIRA et al., 2005). Muitos destes diagnósticos envolvem duas fases; uma reação de amplificação seguida por digestão com uma enzima de restrição para produzir polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição (RFLPs). Hübschen et al. (2004a) reiteraram que teste de PCR em etapa única é preferível, principalmente para uso em laboratórios fitossanitários/quarentenários onde o uso eficiente de materiais de consumo e recursos humanos é fundamental. Avanços tecnológicos melhoraram a sensibilidade, precisão e rendimento de amostras dos diagnósticos moleculares; entretanto, métodos

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this principle with sibling species. The sensitivity of detection of a specific species within a mixture with other nematodes is also an important advance initially demonstrated using controlled mixtures of purified DNA and subsequently validated with the detection of single individuals within a complex mixture of nematodes from a soil community (SUBBOTIN, et al. 2001; HÜBSCHEN et al. 2004a). Now several qPCR assays have been developed which can be used to quantify different species in mixtures. Amplification from low- and single- copy genes is also within the sensitivity of PCR, given the multicellular nature of nematodes, and though this level of sensitivity is technically challenging it offers the potential to differentiate isolates with biological differences such as virulence or avirulence to a specific resistance gene. Other technical improvements in equipment, better and less expensive reagents, new qPCR technologies and robotics will continue to transform the role of molecular diagnostics in nematology in the future. Due to their global economic importance, most of the initial molecular diagnostics focussed primarily on Meloidogyne, Heterodera, Pratylenchus and Globodera (for example, ZIJLSTRA et al., 1995; SHIELDS et al., 1996; UEHARA et al., 1998; SUBBOTIN et al., 1999, 2000), and also a few were targeted at longidorid species (HÜBSCHEN et al., 2004b; OLIVEIRA et al., 2005). Many of these diagnostics involve two-stages; a PCR reaction followed by a restriction enzyme digestion to produce restriction fragment length polymorphisms (RFLPs). Hübschen et al. (2004a) reiterated that a single step PCR test is preferable, particularly for use in phytosanitary/quarantine laboratories where efficient use of both consumables and human resources is necessary. Technological advances have improved the sensitivity, accuracy and sample throughput of molecular diagnostics; however appropriate methods must be used for the

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apropriados devem ser usados para uma determinada necessidade prática do diagnóstico. Por exemplo, um diagnóstico usado por serviços quarentenários, tais como para exame de importações de tubérculos para a presença de Meloidogyne chitwoodi ou M. fallax, que envolve avaliação dos tubérculos por sintomas e isolamento de nematoides do tubérculo, ou diferenciar o nematoide do pinheiro Bursaphelenchus xylophilus do nematoide não patogênico, mas morfologicamente similar, B. mucronatus, em amostras de madeira, apresenta diferentes dificuldades práticas em relação à amostragem, sensibilidade e quantificação que, por exemplo, um teste de solo pré-plantio para nematoides vetores de vírus. Aqui, nós sintetizaremos alguns exemplos dos diagnósticos atuais para os nematoides de maior importância econômica no Brasil. Os diagnósticos de Meloidogyne spp. já foram relatados no Capítulo 3.

particular practical requirements of the diagnostic. For example, a diagnostic used by the quarantine services, such as for screening imports of tubers for the presence of Meloidogyne chitwoodi or M. fallax which involves examination of tubers for symptoms and isolation of individual nematodes from tuber flesh, or distinguishing the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus from the related non-pathogenic but morphologically similar B. mucronatus in wood samples have different practical difficulties with regard to sampling, sensitivity and quantification than, for example, a pre-plant soil test for virus vector nematodes. Here we summarize some examples of current diagnostics for the most economic importance nematodes in Brazil. The diagnostics of Meloidogyne spp. were already reported in Chapter 3.

Há ainda poucos diagnósticos moleculares disponíveis para nematoides do gênero Pratylenchus. Orui (1996), Orui e Mizukubo (1999) e Waeyenberge et al. (2000) identificaram espécies de Pratylenchus usando padrões de PCR-RFLP nas regiões espaçadoras internas (ITS) do rDNA, mas este método exige a digestão dos produtos de PCR com várias enzimas de restrição. Aliás, para identificação usando PCR-RFLP, é necessário confirmar que os padrões de RFLP consistentemente diferem entre as espécies, mas são constantes dentro de uma espécie (ORUI e MIZUKUBO, 1999). Usando a amplificação do DNA com conjuntos de primers espécie-específicos, Uehara et al. (1998) foram capazes de separar P. loosi e P. coffeae. Al-Banna et al. (2004) desenharam cinco primers anversos espécie-específicos da porção variável interna da expansão D3, região do DNAr 28S (LSU), para P. neglectus, P. penetrans, P. scribneri, P. thornei e P. vulnus. Machado et al. (2007) demonstraram, usando tanto testes in silico quanto in vitro, que o primer

There are still few molecular diagnostics available for Pratylenchus nematodes. Orui (1996), Orui and Mizukubo (1999), and Waeyenberge et al. (2000) identified Pratylenchus species using PCR-RFLP patterns in the internal transcribed spacer (ITS) regions of the rDNA, but this required the digestion of PCR products with several restriction enzymes. Indeed, for identification using the PCR-RFLP method, it is necessary to confirm that RFLP patterns consistently differ among species but are constant within a species (ORUI and MIZUKUBO, 1999). Using DNA amplification with species-specific primer sets, Uehara et al. (1998) were able to distinguish between P. loosi and P. coffeae. Al-Banna et al. (2004) designed five forward species-specific primers from the internal variable portion of the D3 expansion region of the 28S rDNA for P. neglectus, P. penetrans, P. scribneri, P. thornei, and P. vulnus. Machado et al. (2007) demonstrated using both in silico


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desenhado para diagnóstico de P. brachyurus foi específico para a espécie-alvo, separando-a de outras espécies de Pratylenchus, além de espécies próximas. A especificidade do primer foi demonstrada pela detecção de uma única espécie-alvo dentro de uma comunidade total do solo composta por espécies de nematoides não alvos, assim como pela ausência de produtos de reação cruzada provenientes de espécies de Pratylenchus não alvos. Adicionalmente, a confiabilidade do primer foi confirmada pela avaliação de populações de P. brachyurus de diferentes localidades brasileiras. Do mesmo modo, baseado em sequências da região ITS-1, um método de PCR simples, usando primer espécie-específico para o diagnóstico do economicamente importante NPP P. jaehni, foi desenvolvido por Consoli et al. (2012). Estes primers espécie-específicos evitam a exigência pelo RFLP subsequente ou a análise da sequência de produto de PCR e podem ser usados como uma ferramenta rápida de diagnóstico em estudos de epidemiologia e de manejo. Atualmente, diversos protocolos de qPCR estão disponíveis para detecção e quantificação de espécies de Pratylenchus, incluindo P. neglectus (YAN et al., 2013), P. penetrans (SATO et al., 2007; MOKRINI et al., 2013), P. thornei (YAN et al., 2012; MOKRINI et al., 2014) e P. zeae (BERRY et al., 2008). Espera-se que o uso destas ferramentas forneça identificação precisa destas espécies de Pratylenchus, capacitando pesquisadores e serviços de extensão e quarentena para estabelecer protocolos de detecção de NPP e, consequentemente, evitar suas introduções.

and in vitro tests that the diagnostic primer designed for P. brachyurus was specific for the target species among other Pratylenchus and related species. Primer specificity was demonstrated by the detection of a single target nematode species within a total soil community comprised of non-target species, as well as producing no cross-reaction products derived from non-target Pratylenchus species. Additionally, primer reliability was confirmed by screening a number of distinct Brazilian populations of P. brachyurus. Similarly, based on ITS-1 region sequences, a simple PCR method using a species-specific primer for the diagnosis of an economically important PPN P. jaehni was developed by Consoli et al. (2012). These species-specific primers obviate the need for subsequent RFLP or sequence analysis of the PCR product and can be used as a rapid diagnostic tool in epidemiological and management studies. Currently, several qPCR protocols are available for detection and quantification of Pratylenchus species, including P. neglectus (YAN et al. 2013), P. penetrans (SATO et al. 2007; MOKRINI et al. 2013), P. thornei (YAN et al. 2012; MOKRINI et al. 2014) and P. zeae (BERRY et al. 2008). The use of these tools are expected to provide an accurate identification of these Pratylenchus species, enabling researchers and extension/quarantine services to establish protocols for detecting PPN and, consequently, avoid their introduction.

Como espécies de Aphelenchoides são muito difíceis de identificar usando somente caracteres morfológicos, ferramentas de diagnóstico molecular foram desenvolvidas para auxiliar a identificação morfológica (IBRAHIM et al., 1994; MCCUISTON et al., 2007; RYBARCZYK-MYDLOWSKA et al., 2012). Métodos moleculares podem ser aplicados para identificação de

As Aphelenchoides species are very difficult to identify using morphological characters alone, molecular diagnostic tools have been developed to support their morphological identification (IBRAHIM et al., 1994; MCCUISTON et al., 2007; RYBARCZYK-MYDLOWSKA et al., 2012). Molecular methods can be applied to identification of all life stages,

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espécimes em qualquer fase do ciclo de vida, incluindo os estádios juvenis, e podem ser particularmente úteis em situações de baixo nível de infestação ou quando os espécimes adultos são atípicos ou foram danificados. Primers espécie-específicos da região ITS1 foram descritos por McCuiston et al. (2007) como um teste de diagnóstico para detecção precoce de A. fragariae diretamente na planta hospedeira. O teste diagnóstico detectou com precisão um único espécime de A. fragariae em mais de 100 amostras naturalmente infestadas, incluindo 50 espécies de plantas ornamentais, algumas das quais infestadas, mas assintomáticas. A capacidade de detectar DNA de A. fragariae em uma mistura de moléculas de DNA, provenientes da planta hospedeira e do nematoide, elimina a necessidade da extração dos nematoides dos tecidos vegetais, etapa que antecede a extração do DNA, e não depende de um especialista treinado para identificação do nematoide. Baseando-se em ensaios de qPCR, Rybarczyk-Mydlowska et al. (2012) mostraram que a região codificadora do DNAr, da subunidade ribossômica menor, tinha variação suficiente para o desenho de primers específicos para detectar quatro espécies economicamente importantes de Aphelenchoides (A. besseyi, A. fragariae, A. ritzemabosi e A. subtenuis). Recentemente, diagnóstico de qPCR desenvolvido por Jesus (2015), para A. besseyi, reduziu significativamente o tempo para detecção, quando comparado ao PCR padrão, com 96 amostras processadas e analisadas simultaneamente em 30 minutos. O teste detectou o DNA alvo extraído de um único espécime de A. besseyi e não apresentou reações cruzadas quando desafiado com espécies próximas, que são frequentemente encontradas em sementes de gramíneas forrageiras. Entretanto, a especificidade dos testes moleculares atualmente disponíveis para Aphelenchoides pode ser limitada, uma vez que eles geralmente foram desenvolvidos e avaliados usando número limitado de espécies e populações de diferentes regiões geográficas.


including the immature stages, and may be particularly helpful when there is a low level of infestation or when adult specimens are atypical or damaged ITS-1 species-specific primers were described by McCuiston et al. (2007) as a diagnostic assay for early detection of A. fragariae directly in host plant material. The diagnostic test accurately detected a single nematode of A. fragariae in more than 100 naturally infected samples including 50 ornamental plant species, some of which were infected yet asymptomatic plants. The ability to detect A. fragariae DNA within a mixture of host plant and nematode DNA eliminates the need to extract nematodes from plant tissues prior to DNA extraction and does not rely on a trained specialist for nematode identification. Based on qPCR assays, Rybarczyk-Mydlowska et al. (2012) showed that the coding region SSU rDNA had sufficient variation for designing specific primers to detect four economically important Aphelenchoides species (A. besseyi, A. fragariae, A. ritzemabosi and A. subtenuis). Recently, qPCR diagnostics developed by Jesus (2015) to detect A. besseyi, significantly reduced the time to detection compared to standard PCR, with 96 samples processed and analyzed simultaneously in 30 minutes. It detected DNA target extracted from a single A. besseyi and had no cross-reactions when challenged with closely related species frequently found associated with forage grass seeds. However, the specificity of currently available molecular Aphelenchoides tests may be limited as they have generally been developed and evaluated using a restricted number of species and populations from different geographic regions.


Poucos diagnósticos moleculares publicados apresentaram como espécies-alvo nematoides longidorídeos (VRAIN et al., 1992; VRAIN, 1993; MOLINARI et al., 1997; KNOETZE et al., 2000; WANG et al., 2003; HÜBSCHEN et al., 2004b; OLIVEIRA et al., 2005). Wang et al. (2003) desenvolveram primers espécie-específicos para X. diversicaudatum, X. index, X. italiae e X. vuittenezi. Diagnóstico espécie-específico, baseado em uma única etapa de PCR, foi desenvolvido por Oliveira et al. (2005), que confiavelmente separaram quatro espécies economicamente importantes de Xiphinema (X. brevicolle, X. elongatum, X. ifacolum e X. longicaudatum). Também, foi possível distinguir claramente populações de X. brevicolle de X. diffusum (que é taxonomicamente muito similar a X. brevicolle), usando primers espécie-específicos. Portanto, com base nos resultados deste estudo, sugeriu-se que X. brevicolle e X. diffusum são diferentes espécies, concordando com Lamberti et al. (1991, 2002). Os primers desenvolvidos por Wang et al. (2003) e Oliveira et al. (2005) podem ser usados em testes multiplex, já que eles produzem fragmentos de PCR de diferentes tamanhos, utilizando o mesmo primer reverso, o que torna esse método eficiente e de baixo custo. Recentemente, aplicando qPCR, Berry et al. (2008) desenvolveram primers espécie-específicos para detecção e quantificação de X. elongatum, parasito de cana-de-açúcar, e Van Ghelder et al. (2015) relataram um método para a detecção específica de X. index e X. diversicaudatum, vetoras de nepoviroses da videira, e das espécies próximas não vetoras X. vuittenezi e X. italiae. Nos dois estudos, primers específicos e sondas foram desenhados a partir da ITS1, permitindo a detecção de um único indivíduo de cada uma das espécies estudadas.

Tylenchulus semipenetrans é o nematoide de maior importância econômica e o mais dissemi-

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Few published molecular diagnostics have targeted longidorid species (VRAIN et al., 1992; VRAIN, 1993; MOLINARI et al., 1997; KNOETZE et al., 2000; WANG et al., 2003; HÜBSCHEN et al., 2004b; OLIVEIRA et al., 2005). Wang et al. (2003) developed species-specific primers for X. diversicaudatum, X. index, X. italiae and X. vuittenezi. A single-step PCR species-specific diagnostic was developed by Oliveira et al. (2005) that reliably discriminated four economically important Xiphinema species ( X. brevicolle, X. elongatum, X. ifacolum and X. longicaudatum). Also, it was possible to clearly distinguish populations of X. brevicolle from X. diffusum (that is taxonomically very similar to X. brevicolle) using species-specific primers. Data from this study suggested that X. brevicolle and X. diffusum were different species concurring with Lamberti et al. (1991, 2002). The primers developed by both Wang et al. (2003) and Oliveira et al. (2005) can be used in a multiplex test as they yield different sized PCR fragments utilising the same reverse primer, thus they are efficient, and inexpensive to use. Recently, based on qPCR, Berry et al. (2008) developed specific primers for detection and quantification of X. elongatum parasites of sugarcane and Van Ghelder et al. (2015) reported a method for the specific detection of X. index and X. diversicaudatum, vectors of grapevine nepoviruses, and of the closely related non-vector species X. vuittenezi and X. italiae. In both studies, specific primers and probes were designed from the ITS1, enabling the specific detection of single individuals of each of the studied species.

7\OHQFKXOXV Tylenchulus semipenetrans is the most economically important and widespread nematode pest of citrus. The identification

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nado em regiões produtoras de citros. A identificação do juvenil de segundo estádio (J2) de T. semipenetrans por caracteres morfológicos é difícil em razão do pequeno tamanho, o que exige especialista bem treinado. É também difícil diferenciar J2 de T. semipenetrans em uma mistura de nematoides extraídos do solo sob um estereoscópio, especialmente se poucos J2 estiverem presentes. Assim, primers espécie-específicos desse nematoide foram desenhados por Liu et al. (2011), baseados em sequências das regiões ITS do DNAr. O teste foi suficientemente sensível para amplificar o DNA de um único J2 ou diferentes formas de T. semipenetrans. Especificidade e confiabilidade dos primers foram validadas por amplificações de 16 populações adicionais de T. semipenetrans, coletadas em quatro províncias da China. Os primers detectaram com sucesso um único J2 de T. semipenetrans dentro de uma comunidade de nematoides, abrangendo um grande número de nematoides não alvo. A técnica de diagnóstico desenvolvida pode ser usada para a identificação precisa de T. semipenetrans e, também, como uma ferramenta de decisão no manejo de nematoides em citros.

of second-stage juveniles (J2) of T. semipenetrans by morphological characters is difficult due to their small size and requires a well-trained specialist. It is also often difficult to distinguish J2 of T. semipenetrans from the nematodes collected from soil under a stereoscope, especially when few J2 are present. Species-specific primers for this nematode were designed by Liu et al. (2011) based on rDNA-ITS. The assay was sufficiently sensitive to amplify DNA from a single J2 or different life stages of T. semipenetrans. Specificity and reliability of the primers were validated by further PCR amplification of 16 extra populations of T. semipenetrans collected from four provinces of China. The primers successfully detected a single J2 of T. semipenetrans within a whole nematode community comprising large number of non-target nematodes. The developed diagnostic can be used for accurate identification of T. semipenetrans and also as a decision tool for nematode management for citrus.

Fallas et al. (1996) estudaram a diversidade molecular e bioquímica entre isolados de Radopholus spp. de diferentes áreas do mundo. Os autores descreveram um método de PCR-RFLP, usado para comparar 10 isolados de R. similis de várias regiões produtoras de banana em todo o mundo. A variação intraespecífica foi mais estudada por Elbadri et al. (2002). Ravindran et al. (2011) desenvolveram um método baseado em PCR, duplex em um único tubo, para detectar o patógeno oomiceto (Phytophthora capsici) e R. similis em raízes infectadas de pimenta-do-reino (Piper nigrum). Este método envolve o uso de dois conjuntos de primers desenhados da região ITS de P. capsici e das sequências do DNAr de R. similis e pode ser adotado por agências de serviços de extensão e quarentena para a indexação simultânea dos dois importantes patógenos de solo em plântulas de pimenta.

Fallas et al. (1996) studied the molecular and biochemical diversity among isolates of Radopholus spp. from different areas of the world. The authors described a PCR-RFLP method used to compare 10 isolates of R. similis from various banana-growing areas. Intra-specific variation was studied further by Elbadri et al. (2002). Ravindran et al. (2011) developed a single tube duplex PCR based method to detect an Oomycetes pathogen (Phytophthora capsici) and R. similis in infected roots of black pepper. This method involved the use of two sets of primers designed from the ITS region of P. capsici and rDNA sequences of R. similis and can be adopted by developmental agencies for simultaneous indexing of both these major soil borne pathogens in black pepper plantlets.


Com base na combinação de padrões de RFLP, H. glycines pode ser separado de outras espécies de nematoides de cisto. Também, vários protocolos PCR-ITS-RFLP foram desenvolvidos para identificação do nematoide de cisto da soja (SZALANSKI et al., 1997; SUBBOTIN et al., 2000; ZHENG et al., 2000; TANHA MAAFI et al., 2003). Métodos de primers espécie-específicos foram desenvolvidos para detecção de J2 desse nematoide, mesmo em amostras mistas com outros nematoides de cisto e de solo (SUBBOTIN et al., 2001). Ye (2012) desenvolveu um método de qPCR para identificação da espécie do nematoide de cisto da soja na Carolina do Norte, EUA. A sensibilidade e precisão desse teste, fez da qPCR um método ideal para o diagnóstico da espécie.

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Based on the combination of RFLP profiles, H. glycines can be distinguished from other cyst nematode species as several PCRITS-RFLP protocols have been developed for identification of soybean cyst nematode (SZALANSKI et al., 1997; SUBBOTIN et al., 2000; ZHENG et al., 2000; MAAFI et al., 2003). Also, species-specific primer methods have been developed to detect second-stage juveniles of the soybean cyst nematodes even in samples mixed with other cyst and soil inhabiting nematodes (SUBBOTIN et al., 2001). Ye (2012) developed a qPCR method for species identification of soybean cyst nematode in North Carolina, USA. The sensitivity and accuracy of this test made qPCR an ideal method for species diagnosis.

&RQVLGHUDo}HV¿QDLV É difícil antever os caminhos do diagnóstico de nematoides no futuro, mas, considerando o rápido avanço em várias tecnologias relevantes, é muito provável que haverá impactos significativos e benefícios a serem alcançados, particularmente quando essas tecnologias forem transferidas de outras áreas da fitopatologia. A revisão recente de Khiymai et al. (2014) sintetizou muitos desenvolvimentos interessantes em nanodiagnóstico aplicados à fitopatologia, incluindo métodos e equipamentos que facilitarão a identificação no campo. Exemplos do uso de sistemas portáteis de reação em cadeia da polimerase, do sequenciamento de alto rendimento e da microfluídica são discutidos a seguir para ilustrar o amplo potencial dos novos diagnósticos que estão sendo desenvolvidos. LAMP-PCR foi desenvolvida pela Eiken Chemical Company em 2000, com o procedimento sendo descrito por Notomi et al. (2000), e já demonstrou ter potencial para diagnóstico de nematoides no campo. Apresenta vantagens sobre a PCR convencional, uma vez que somente dispositivos de aquecimento simples são neces-

Future approaches to nematode diagnostics are difficult to forecast but given the rapid advances in various relevant technologies it is very likely that there will be significant impacts and benefits to be gained, particularly when these technologies are transferable from other areas of plant pathology. A recent review by Khiymai et al. (2014) summarized many interesting developments in nanodiagnositics for plant pathology, including diagnostic methods and equipment that will facilitate in-field identification. Examples using portable polymerase chain reaction systems, high throughput sequencing and microfluidics are described below to illustrate the wide range of potential novel diagnostics that are being developed. LAMP-PCR was developed by the Eiken Chemical Company in 2000 and the procedure is described by Notomi et al. (2000) and has already been demonstrated to have in-field potential for nematode diagnostics. It has an advantage over conventional PCR in that only simple heating devices

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sários para manter temperaturas constantes, o método é relativamente rápido e não exige DNA altamente purificado. LAMP-PCR usa um conjunto de quatro a seis primers e uma DNA polimerase com atividade de deslocamento de fita (Bst DNA Polimerase) para amplificar DNA com alta especificidade sob condições isotérmicas em menos de uma hora, sem o uso de termociclador. Primers podem ser desenhados usando o software PRIMEREXPLORE V4 (http://primerexploer.jp). Várias formas podem ser usadas para determinar se a amplificação do alvo ocorreu, incluindo a observação a olho nu, se corantes intercalantes tais como SYBR green ou Quant-iTPicoGreen são usados, fazendo com que a análise eletroforética dos produtos de amplificação deixe de ser necessária, ou ainda a quantificação com biosensores com nanopartículas. Um outro método é a detecção por tira de fluxo lateral, que exige marcação com biotina para a amplificação e hibridização de sonda marcada com FITC à sequência-alvo após a amplificação e, em seguida, aplicação da amostra às tiras HybriDetect (Mienia Biotec, Alemanha). Estas tiras detectam fragmentos contendo tanto biotina do primer quanto FITC da sonda interna. Kikuchi et al. (2009) mostraram que LAMP-PCR poderia ser usada em campo para detectar Bursaphelenchus xylophilus em amostras de madeira. Nui et al. (2012) usaram a análise de LAMP para M. enterolobii com primers baseados no DNAr 5S e na região espaçadora intergência 2 (IGS2). Eles relataram que a análise foi 10-100 vezes mais sensível que a PCR convencional, com sensibilidade de detecção de 10 fg de DNA genômico. Nesta análise, foram usadas amostras de raízes e solo. A análise de LAMP para Radopholus similis (PENG et al., 2012), usando DNAr D2-D3, foi relatada para uso em campo com plântulas de bananeira, Anthurium e citros. O poder da moderna tecnologia de sequenciamento proporciona outra abordagem para monitorar NPP, e o contínuo desenvolvimento dessa tecnologia provavelmente levará a sistemas mais baratos, precisos e portáteis. Esse novo potencial já foi utilizado por Porazinska


are required that maintain constant temperatures, the method is relatively fast and doesn’t require highly purified DNA. LAMPPCR uses a set of four to six primers and a DNA polymerase with strand displacement activity (BstDNA polymerase) to amplify DNA with high specificity under isothermal conditions in