Panax notoginseng saponins protect against chronic ...

Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences 

http://www.jcps.ac.cn 

361 

Panax  notoginseng  saponins  protect  against  chronic  ethanol­induced  hepatic steatosis  Renbo Ding, Jiaolin Bao, Yiwei Cao, Chengwei He, Yitao Wang, Jianbo Wan *  State  Key  Laboratory  of  Quality  Research  in  Chinese  Medicine,  Institute  of  Chinese  Medical  Sciences,  University  of  Macau,  Macao 999078, China 

Abstract: Chronic alcohol consumption induces hepatic steatosis, the early stage of alcoholic liver disease (ALD). The aim of  present study is to investigate the protective effect of Panax notoginseng saponins (PNS) against chronic ethanol­induced hepatic  steatosis  in  vivo.  Mice  were  pair­fed a  modified  Lieber­DeCarli liquid  diet  containing alcohol  or  isocaloric  maltose  dextrin  as  control diet with or without PNS (200 mg/kg, BW) for 8 weeks. Animals supplemented with PNS were protected against hepatic  lipid accumulation induced by chronic ethanol exposure. Accordingly, PNS could significantly decrease the elevation of plasma  triglyceride,  plasma  enzyme  activities, i.e. alanine aminotransferase  (ALT)  and aspartate aminotransferase (AST), and hepatic  TNF­α  and  IL­6  levels  which  were  induced  by  chronic  alcohol  exposure.  In  addition,  PNS  markedly  reduced  the  lipolysis  of  white adipose tissue (WAT) that stimulated by alcohol feeding through the inhibiting protein expression of phosphorylation of  hormone­sensitive lipase (p­HSL), rather than total HSL. Furthermore, alcohol exposure also enhanced fatty acid uptake capacity  in  liver  by  elevated  hepatic  CD36  expression,  which  could  attenuated  by  PNS  treatment.  These  results  demonstrate  that  PNS  supplementation protects against chronic ethanol­induced hepatic steatosis, which is associated with ameliorating dysfunctional  lipid  metabolism  of  WAT  and the  reduced  inflammatory  cytokines.  Our  findings  suggested  that  PNS  might  be  potential to  be  developed as an effective agent for the treatment of chronic alcoholic steatosis.  Keywords: Alcoholic fatty liver, Panax notoginseng saponins, Lipolysis, Inflammation  CLC number: R96 

Document code: A 

Article ID: 1003–1057(2014)6–361–08 

1. Introduction  Long­term  excess  alcohol  consumption  leads  to  fatty  liver  (hepatic  steatosis),  characterized  by  lipid  droplet  accumulation  (mainly  triglycerides,  or  TG)  in  hepatocytes [1] .  Fatty  liver  was  initially  assumed  to  be  a  benign  and  reversible  condition [2] .  An  increasing  number of evidence has demonstrated that fatty liver is  a potentially pathologic condition that may progress to  the  advanced  stage  of  alcoholic  liver  disease  (ALD),  such  as  hepatitis,  cirrhosis  and  hepatic  carcinoma [1–3] .  Despite severe health impact of hepatic steatosis, there  is still no effective approach to reverse the pathogenesis  and  progression  of  hepatic  steatosis,  except  alcohol  abstinence [4] .  However,  for  alcohol­dependent  patients  Received: 2014­04­22, Revised: 2014­05­06, Accepted: 2014­05­10.  Foundation items: Research Committee of the  University  of  Macau  (Grant   No.   MYRG123­ICMS12   and   MYRG111­ICMS13)   and  from Macao Science and Technology Development Fund (Grant No.  010/2013/A1).  *  Corresponding author. Tel.: +853­3974873, Fax: +853­28841358,  E­mail: [email protected]  http://dx.doi.org/10.5246/jcps.2014.06.049 

and for patients with severe forms of ALD, drug therapy  is urgently needed.  Root of Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen, also  called as Sanqi in Chinese, is a highly­valued medicinal  herbs  that  has  been  traditionally  applied  to  clinic  for  preventive   and  therapeutic   purposes,   especially  for  cardiovascular   diseases  and  hepatic  diseases,   either  alone   or   in   combination [5] .  Panax   notoginseng  is  contained in several famous Chinese traditional formula,  such  as  ‘‘Pian  Zi  Huang’’  which  is  used  for  the  treatment  of  several  types  of  hepatitis.  Dammarane  triterpene  saponins  are  generally  considered  to  be  the  major  bioactive  constituents  in  P.  notoginseng [5,6] .  An  increasing  number  of  in  vivo  and  in  vitro  studies  have demonstrated that P. notoginseng and its saponins  exerted   extensively   beneficial   effects   on   several  systems, including hematological [7] , immune system [8] ,  cardiovascular   system [9] ,   central   nervous [10]  and  endocrine  system [11] .  In  the  present  study,  the  effects  of  PNS  on  chronic  ethanol­induced  hepatic  steatosis  and its molecular mechanisms were investigated.

362 

Ding, R.B. et al. / J. Chin. Pharm. Sci. 2014, 23 (6), 361–368 

2. Materials and methods 

2.4. Determination of hepatic lipid accumulation 

2.1. Animals 

Hepatic  lipid  accumulation  was  qualitatively  examined  by  hepatic  histology  and  quantitatively  determined  by  a Triglyceride Quantification Kit. For hepatic histology,  liver  cryostat  sections  (8  µm)  were  fixed  with  4%  phosphate­buffered paraformaldehyde, stained with Oil  red O (Sigma­Aldrich, St. Louis, MO) and counterstained  with  hematoxylin  (Sigma­Aldrich)  using  a  standard  technique. The stained sections examined and recorded  by Olympus CX­31 light microscopy with CCD camera  (Olympus  Crop.  Tokyo,  Japan).  For the  quantification  of hepatic triglyceride level, 50 mg of liver tissue was  homogenized in 450 μL of chloroform–methanol solution  (2:1, v/v). After extraction for 24 h at 4 ºC, samples were  added 500 μL phosphate­buffered  saline  then  centrifuged  at 2000 r/min for 15 min. The organic layer was removed  to new tubes and dried under nitrogen. The resulting  pellet  was  dissolved  in  100  μL  phosphate­buffered  saline containing 1% Triton X­100 and the triglyceride  contents were determined by using a Triglyceride Quanti­  fication  Kit  (Beijing  BHKT  Clinical  Reagent  Co.,  Ltd,  Beijing,  China)  according  to  the  manufacturer’s  protocol [12,13] .  The  plasma  triglyceride  levels  of  mice  were  also  examined  using  the  same  kit.  The  value  of  hepatic  triglyceride  content  was  normalized  to  tissue  weight and expressed as mg/g of liver. 

C57BL/6 male mice, weighting 20–25 g, were obtained  from Laboratory Animal Services Centre, The Chinese  University  of  Hong  Kong  (Hong  Kong,  China).  Mice  were maintained on individually ventilated cage (IVC)  system in a temperature­ and humidity­controlled room  ((22.5±0.5)  °C,  (50±5)%  humidity)  with  a  12  h  light­  dark cycle, and allowed free access to food and water.  The  animal  studies  were  approved  by  Animal  Ethics  Committee,   Institute   of  Chinese   Medical   Sciences,  University of Macau (Approval No. AEC­13­002).  2.2. Liquid diet and PNS preparation  Due  to  the  tendency  of  animals  given  ethanol  to  reduce  their  solid  food  consumption,  animals  were  fed  with  liquid  diet.  Liquid  diets  were  based  on  the  Lieber­DeCarli formulation and purchased from Trophic  Animal  Feed  High­tech  Co.  Ltd.  (Nantong,  China).  The  Lieber­DeCarli  ethanol­containing  diet  consisted  of 35% of total energy as fat, 18% as protein, 11% as  carbohydrate,  and  36%  as  ethanol.  In  the  Lieber­DeCarli  control diet, ethanol was replaced as isocaloric maltose­  dextrin. PNS was purchased from International Laboratory  Inc. (San Francisco, CA) with the labeled purity of over  95%.  PNS  was  dissolved  in  Lieber­DeCarli  ethanol­  containing  liquid  diet.  All  the  liquid  diets  are  freshly  prepared for the experiment.  2.3. Establishment of alcoholic fatty liver model  After  7 d acclimation to  liquid  diet, all mice  (eight­  week  old)  were  randomly  divided  into  three  groups,  e.g.  control  group,  ethanol  group  and  PNS  treatment  groups (200 mg/kg, BW). Each group contains 6 mice.  Mice  in  either  ethanol  group  or  PNS  treatment  group  were  fed  Lieber­DeCarli  ethanol­containing  liquid  diets  with  or  without  PNS  supplement  progressively.  Specifically,  ethanol  was  introduced  at  12%  of  total  energy  in the diet  for 2  d, 24%  of  total  energy  for the  subsequent 2 d, and 36% of total energy thereafter. The  control  group  animals  were  received  the  Lieber­DeCarli  control  liquid  diet.  After  8  weeks  feeding,  all  mice  were euthanized, and plasma, liver and epididymal fat  were  collected.  The  portion  of  tissues  from  the  same  lobe  of  liver  in  each  mouse  was  embedded  in  OCT  (Frozen tissue matrix) for histological analysis. 

2.5. Plasma measure of hepatotoxicity  Plasma   biochemical   markers,   including   alanine  aminotransferase  (ALT)  and  aspartate  amino  transferase  (AST),  are  often  used  to  indicate  liver  damage [14] .  To  examine  the  effect  of  PNS  on  ethanol­induced  hepato  toxicity,  ALT  and  AST  activities  in  the  plasma  were  determined using commercial spectro photometric kits  (Nanjing  Jiancheng  Bioengineering  Institute,  Nanjing,  China) following the manufacturer’s protocol.  2.6. Assessment of adipose tissue lipolysis  Lipolysis of epididymal adipose tissue was measured  as  free  fatty  acid  released  into  the  culture  medium  ex  vivo at the different time points. Briefly, adipose tissue  explants were washed in culture plates with pre­warmed  Dulbecco’s  PBS  containing  100  U/mL  penicillin  and  100  μg/mL  streptomycin.  After  removing  possible  connective tissue and blood vessels, 30 mg of epididymal  adipose  tissue  was  transferred  to  12­well  plates,  cut  into  small  pieces,  and  cultured  in  2  mL  Dulbecco’s

Ding, R.B. et al. / J. Chin. Pharm. Sci. 2014, 23 (6), 361–368 

modified   Eagle’s   medium   (DMEM)   supplemented  with  L­glutamine (2 mM), penicillin (50 U/mL), strep­  tomycin  (50  μg/mL),  and  2%  fatty  acid­free  bovine  serum albumin. Free fatty acids released into the culture  medium at the time points of 0, 1, 2 and 3 were determined  by Fatty Acid Quantification Kit (Biovision, Milpitas, CA)  according to its manufacturer's instructions [15,16] . Plasma  free fatty acid was also measured using the same kit.  2.7. Measurement of hepatic cytokines  Hepatic  cytokines,  including  TNF­α  and  IL­6,  were  measured  in  50  mg  of  liver  tissue  that  had  been  homogenized  in  450 μL  PBS  containing  0.5%  Triton  X­100 and 1% protease inhibitors. After centrifugation  at 12 000 g for 10 min, the levels of TNF­α and IL­6 in  the  supernatant  were  examined  using  Mouse  TNF­α  ELISA  MAX™  Standard  kit  and  Mouse  IL­6  ELISA  MAX™   Standard  kit   (BioLegend  Inc.,  San  Diego,  CA),   respectively,   according  to  the  manufacturer’s  instructions [17] .  The  values  were  normalized  to  total  protein, and expressed as pg/mg of protein. 

363 

a polyvinylidene fluoride membrane and blocked  with  5% nonfat  dry  milk  in Tris­buffered  saline  with  0.1%  Tween­20.  Then,  the  membrane  was  immunoblotted  with primary antibody against  HSL, Phospho­HSL, and  GAPDH (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA)  at  4  ºC  for  overnight.  After  washing,  the  membranes  were  incubated  with  anti­rabbit  IgG  (Cell  Signaling  Technology)  at  room  temperature  for  1  h,  the  bands  were visualized using Amersham ECL Select Western  Blotting Detection Reagent (GE Healthcare Bio­Sciences.,  Piscataway,  NJ)  under  a  Bio­Rad  ChemiDoc™  XRS  System (Bio­Rad Laboratories, Hercules, CA).  2.10. Statistical analysis  All  values  are  expressed  as  mean±SD.  Student’s  t­test  was used for between­group comparison using GraphPad  Prism 5.0  software, and  differences  between  groups  were  considered significant at P