Potentialites hematopoietiques de tissus ... - Development

/. Embryo!, exp. Morph. Vol. 33, 2, pp. 259-278, 1975 Printed in Great Britain

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Potentialites hematopoietiques de tissus embryonnaires et adultes analysees par greffe a des poussins irradies Par JACQUES SAMARUT ET VICTOR NIGON 1 Departement de Biologie generate et appliquee, Villeurbanne

SUMMARY

Differentiation of haemopoietic tissues from embryos and adults injected into irradiated chickens Irradiated chicken are injected with haemopoietic tissues from adult or 11-day-old embryos. Development of stem cells gives rise to well-defined erythrocytic colonies on the surface of the tibial marrow. Erythropoietic production appears to be similar from adult marrow and embryonic blood stem cells; production from injected vitelline stem cells seems to be between 3 and 4 times higher than that of adult marrow stem cells. Results are discussed on the basis of two hypotheses: - existence of an extramedullary erythropoietic site in the host after vitelline cells grafting; - development of vitelline stem cells in the host marrow with kinetic patterns different from those of grafted adult marrow or embryonic blood stem cells. Anyway, the 11-day-old embryo appears to contain at least two types of blood stem cells with distinctive properties. Developmental origin, relationship and future of these different stem cells remain to be analysed.

INTRODUCTION

Au cours du developpement embryonnaire des Vertebres, on observe une evolution de l'activite erythropoietique caracterisee tant par la sequence des hemoglobines produites que par la succession des organes erythropoietiques mis en jeu. Chez le jeune embryon de poulet, la paroi du sac vitellin represente le principal site erythropoietique. Vers la fin du developpement embryonnaire, l'activite se concentre, au contraire, dans la moelle, ou elle se poursuit apres l'eclosion. Quelles sont les relations genetiques entre ces diverses lignees erythropoietiques qui se succedent au cours du developpement? Selon Moore & Owen (1967), les cellules souches hematopoietiques du sac vitellin de l'embryon de poulet colonisent tous les autres centres hematopoietiques de l'embryon. En effet, Pinjection de cellules du sang ou du sac vitellin d'un embryon a un 1

Adresse cfauteurs: Departement de Biologie generate et appliquee, 43, Boulevard du 11 novembre 1918 69621 Villeurbanne, France. i7

EMB

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J. SAMARUT ET V. NIGON

embryon irradie de sexe different et possedant done des structures chromosomiques reconnaissables, permet d'identifier une colonisation de la rate, de la moelle, de la bourse de Fabricius et du thymus par des cellules issues du greffon. De meme, l'echange de sang etabli par parabiose entre deux embryons de sexes differents montre une colonisation des centres hematopoietiques de chaque embryon par les cellules provenant de l'autre embryon et transitant dans la circulation sanguine (Moore & Owen, 1965). Chez l'embryon de souris, les travaux de Moore & Metcalf (1970) et Metcalf & Moore (1971) ont conduit ces auteurs a proposer un modele similaire a celui propose pour l'embryon de poulet. Les observations de Rifkind, Chui & Epler (1969) tendent cependant a montrer que rerythropoiese hepatique prend naissance a partir de cellules mesenchymateuses en place dans l'organe lui-meme. Chez les Batraciens, les greffes d'ilots sanguins triploides sur des embryons diploides ont mis en evidence l'independance genetique entre les lignees erythropoietiques de l'embryon et du tetard (Hollyfield, 1966; Deparis, 1968, 1974). Au regard de ses contradictions vis a vis des conclusions adoptees par les autres auteurs, la these de Moore & Owen ramenant l'origine de l'ensemble de l'erythropoiese du poulet aux cellules du sac vitellin n'apparait pas entierement convaincante. En effet, s'il existait chez l'embryon un organe different du sac vitellin et susceptible de produire des cellules souches hematopoietiques, cellesci se retrouveraient sans doute egalement dans le sang circulant et partant dans le sac vitellin. En outre, la duree des experiences faites par ces auteurs est trop limitee pour permettre de caracteriser pleinement les aptitudes des cellules greffees. Nous avons done repris des experiences similaires en utilisant comme receveurs des poussins irradies et en comparant l'effet, sur ces poussins, d'injections provenant d'organes hematopoietiques de l'embryon et de l'adulte. Chez un tel hote, la definition des parametres de l'erythropoiese peut, en effet, etre poussee beaucoup plus loin que chez des embryons.

MATERIEL ET METHODES

Tous les animaux utilises sont de race Leghorn. Les irradiations sont pratiquees par groupe de quatre poussins maintenus en position accroupie dans une boite de contention en plexiglass. Ces poussins, ages de trois semaines, recoivent 760 R le premier jour et 990 R 24 h plus tard. Le generateur de rayons X est du type Stabilipan Siemens. Le rayonnement est mesure a l'aide d'un dosimetre Radocon-Victoreen en placant la sonde dans l'air au centre du volume fictif normalement occupe par un animal. Le debit de 76 R par minute est obtenu dans les conditions suivantes: distance sourcecible 56,5 cm; filtre 0,2 mm Cu; 170 kV, 20 mA. La preparation des cellules est effectuee sterilement. Les instruments, la verrerie et les liquides servant a la preparation des milieux sont sterilises par chauffage.

Tissus hematopo'ietiques injectes a des poussins irradies

261

Moelle. La moelle est obtenue a partir d'animaux considered comme adultes et ages de deux mois et demi. Les deux tibias et les deux femurs sont preleves, puis fendus dans le sens de la longueur. La cavite medullaire est curetee avec des pinces a bouts recourbes et la moelle est recueillie dans du milieu TC 199 en solution de Earle (BD Merieux) pH 7,2 tamponne a l'HEPES (Acide 7V-2Hydroxyethyl Piperazine-JV-2-Ethanesulfonique, Eurobio) additionne de penicilline (Specilline G 10000 iu/lOOml) et de streptomycine (0,01 g/lOOml). La moelle est dissociee d'abord a l'aide de pinces fines, puis par passages repetes dans une seringue de 10 ml sans aiguille. La suspension est filtree sur trois couches de gaze puis centrifugee 10 min a 300 g a 4 °C. Le culot de cellules est resuspendu et centrifuge a nouveau dans les memes conditions. La suspension est enfin denombree au moyen d'une cellule de Malassez et la concentration des cellules est ajustee, de telle sorte que le volume de suspension injecte ne depasse pas 0,6 ml. La vitalite des cellules est verifiee par le test du bleu trypan: les preparations comportent au moins 90 % de cellules vivantes. Sac vitellin. Les oeufs sont ouverts au lleme jour d'incubation. Avant son ouverture, la coquille est nettoyee avec un tampon de coton imbibe d'alcool. L'embryon est recueilli, avec ses annexes, dans du serum physiologique sterile. La paroi vitelline est decoupee en totalite puis placee dans du tampon phosphate de Dulbecco (PBS) sans Ca 2+ ni Mg 2+ pH 7,2 additionne de penicilline (Specilline G 10000 iu/100 ml) et de streptomycine (0,01 g/100 ml). Elle est dilaceree a l'aide de pinces fines. Le milieu est additionne de trypsine (BD-Merieux) a la concentration finale de 0,25 %. L'ensemble, soumis a une agitation constante par un barreau magnetique, est incube 30 min dans un bain-marie a 38 °C. En fin d'incubation, la suspension est homogeneisee par passages repetes dans une seringue de 10 ml sans aiguille, puis filtree sur trois couches de gaze. Elle est ensuite lavee trois fois par centrifugations de 15 min a 300 g a 4 °C, dans une solution PBS. La numeration et la dilution sont effectuees comme pour la moelle. La preparation contient 90 % de cellules vivantes. Sang d'embryon. Le sang d'embryon de 11 jours est obtenu par aspiration a partir de veines vitellines sectionnees. Les cellules sont recuperees dans une solution PBS sans Ca 2+ ni Mg 2+ puis centrifugees 10 min a 300 g, a 4 °C. Le culot est lave une fois et la suspension est denombree; la concentration en cellules est ajustee comme pour la moelle. Greffe. La greffe est effectuee par injection dans une veine de l'aile. Les temoins recoivent un volume de solution PBS identique au volume de suspension injecte. Observation des parametres hematologiqu.es. Les taux d'erythroblastes polychromatophiles et les myelogrammes sont determines sur 1000 cellules environ a partir de frottis colores au May Griinwald Giemsa. Les numerations sont effectuees a l'aide d'une cellule de Malassez. Les animaux sont sacrifies par decapitation et la moelle d'un tibia est recueillie dans du liquide de Hanks ou elle est dilaceree puis denombree. L'autre tibia est utilise pour la confection de frottis. 17-2

262


Pour la mesure du volume sanguin, les animaux recoivent une injection intraveineuse de 0,3 ml d'une solution de Bleu Evans a 50 mg/100 ml. Au bout de 5 min, le sang est recueilli apres decapitation et la densite optique du serum est lue a 600 nm. Comptage des colonies medullaires erythropo'ietiques chez les animaux irradies et greffes. Les animaux sont sacrifies par decapitation. La paroi des tibias est fendue dans le sens de la longueur au moyen d'une petite scie circulaire de dentiste. Les os sont: ensuite maintenus dans du liquide de Hanks ou la cavite medullaire est ouverte et la moelle recueillie integralement avec precaution. Les colonies erythrocytaires apparaissent a la surface de la moelle sous la forme de petites taches rouges de 0,5 mm de diametre. Le denombrement des colonies est rendu plus aise apres fixation de la moelle et coloration des colonies. Pour cela, le boudin de moelle est plonge dans du liquide de Carnoy pendant une nuit a 4 °C. Le fixateur est ensuite elimine par deux lavages de 10 min dans Pethanol a 95°. Les boudins de moelle sont plonges pendant 4 min dans une solution de benzidine (1 g de benzidine dans 100 ml de methanol), puis dans une solution d'eau oxygenee 110 volumes diluee 100 fois dans l'ethanol 70°, jusqu'a l'apparition des colonies colorees en vert a la surface de la moelle. Leur denombrement est effectue immediatement sous la loupe au grossissementx 12,5. Mesure de rendement de la greffe. La technique utilisee est celle decrite par Siminovitch, McCulloch & Till (1963) pour les CFU spleniques chez la souris. Des poussins de trois semaines irradies recoivent une injection de 2 x 108 cellules de moelle adulte ou de 5 x 108 cellules de sac vitellin d'embryon de 11 jours. Deux heures apres l'injection, les animaux sont sacrifies et leurs tibias sont immediatement preleves. La totalite de la moelle d'un tibia est injectee a un poussin de 3 semaines irradie. Le nombre de colonies par tibia, chez les receveurs secondaires, est determine 6 jours apres la greffe. Les nombres de colonies observes sont corriges en tenant compte du fait que 0,05 ml de suspension reste dans le cone de l'aiguille lors de l'injection. Le rendement de la greffe est calcule selon les modalites que Ton trouvera page 270. RESULTATS

I. Nature des cellules grejfees. Caracteristiques des temoins A. Contamination de la preparation de sac vitellin par le sang circulant La preparation effectuee a partir du sac vitellin contient des cellules de la paroi vitelline proprement dites et des cellules apportees par le sang. Chez l'embryon de 11 jours, le sang circulant comporte essentiellement des normocytes ainsi que des normoblastes et une faible proportion de megalocytes. On considere que tous les erythrocytes murs appartiennent a la fraction du sang circulant. Soient a le pourcentage de ces cellules dans le sang et b leur pourcentage dans la preparation de sac vitellin. La contamination de celle-ci par les

Tissus hematopo'ietiques

injectes a des poussins irradies

263

Tableau 1. Contamination des cellules de sac vitellin par des cellules du sang embryonnaire Sang circulant d'embryon de 11 jours (valeurs moyennes obtenues a partir de trois embryons) Normocytes Megalocytes Normocytes Megalocytes

Sac vitellin A

Preparation I

Preparation II

A

Degre de Degre de contaminacontamination par les tion par les Cellules cellules cellules Cellules dans la issues issues dans la preparation du sang preparation du sang 39,0 32,0

28,9 2,1

74,0 6,6

23,5 1,9

13,8

11,2

33,0 30,0 12,4

Tableau 2. Composition cellulaire de la moelle chez les animaux te'moins et chez les animaux greffes Animaux temoins

Animaux irradies et greffes avec

A

Cellules erythrocytaires Erythrocytes murs Erythroblastes polychromatophiles Proerythroblastes et erythroblastes basophiles Cellules granulocytaires Cellules lymphocytaires et monocytaires Cellules thrombocytaires Nombre total de cellules

Sang Moelle de Sac vitellin d'embryon 2,5 mois 8 x 108 cell 8xl0 8 cell 8xl0 8 cell — 24,0x10' 9,1 x 107 3,0x10' — 9,2x10' 5,5x10' — 12,6x10'

irradies 25,0 x 10' 13,1x10' 10,2x10'

Irradies non greffes 4,4 xlO7 4,2x10' 0,2x10'

1,7x10'

0

0,6x10'

—

2,2 x 10'

5,0x10' 0,4x10'

0

0,1 x 10'

0,5 x 10' 0,2 x 10'

— —

0,7 x 10' 1,2x10'

0,1 x 10'

—

0,2 x 10'

9,9 x 10'

2,2x10'

26,1x10'

Non

0,2 x 10' 30,6 x 10'

0

4,5 x 10'

Tous les animaux sont ages de 3 semaines apres l'eclosion. Les animaux irradies (greffes ou non) sont etudies 6 jours apres l'irradiation. Le nombre d'animaux etudies est de 5 pour chaque modalite de traitement. Les chiffres correspondent a la population cellulaire par tibia. Les valeurs presentees pour les animaux greffes sont celles de la population cellulaire issue du greffon, calculees en deduisant des chiffres totaux les nombres de cellules qui subsistent dans la moelle des animaux irradies non greffes. Les diverses valeurs du tableau ont ete calculees en multipliant la frequence des divers types cellulaires, determined d'apres les myelogrammes, par le nombre total de cellules recuperees par tibia. Ce mode de calcul ne tient pas compte de la proportion de cellules detruites au cours de la dilaceration de la moelle. On peut estimer que ce taux de destruction est identique pour toutes les moelles etudiees.

l,6xlG 6 ± 0,6 xlO 6 10,0±l,3 16,0xl0 9 ± 6,8 x 109 0 0

2,7xlO 6 ± 0,2 xlO 6 10,5 ±2,1 28,4xlO9± 3,2 x 108 5,5 1,56 xlO9

2,3xlO 6 ± 0,5 xlO6 9,8 22,6 x 10"

0,02

0,02

0,02

2,5xlO 6 ± 0,5 xlO 6 10,3 ± 2 0 25,8xlO 9 ± 6,0 x 109 2,5 0,65 x 109

0,06

0

0,20

2,6xlO 6 ± 0,4 x 106 8,5 ±2,5 22,2xlO9± 4,2 xlO9 2,7 0,60 xlO9

0,05

0,04

0,22

0,20

Moelle de 2,5 mois 8 x 108 cell

0

0,14

Sang d'embryon 8 x 108 cell

0,88

Sac vitellin 8 xlO 8 cell 0,60

0

0,43

Irradies non greffes

Animaux irradies et greffes avec

0,2 0,05 x 109 Tous les animaux sont ages de 3 semaines apres 1'eclosion. Les animaux irradies (greffes ou non) sont etudies 6 jours apres l'irradiation. Pour chaque traitement, 5 animaux ont ete etudies. La valeur du volume sanguin apres greffe de sang d'embryon a ete calculee en considerant que le volume sanguin n'etait pas modifie par le type de traitement. Elle a ete estimee par la moyenne des mesures obtenues chez tous les animaux irradies.

% d'erythroblastes polychromatophiles Nombre de polychromatophiles sanguins

Volume sanguin en ml Nombre total de cellules erythrocytaires

Dans le sang circulant Cellules erythrocytaires par mm3

Dans la moelle % de cellules en mitose Proerythroblastes + erythroblastes basophiles Erythrocytes murs Cellules granulocytaires Cellules erythrocytaires Cellules lymphocytaires et monocytaires Cellules erythrocytaires

Non irradies

Animaux temoins

Tableau 3. Effets de la greffe sur divers parametres hematologiques

to

O O

H W H

p

OS


6 /

30 -

JB

265

20 •

/

/ 10 ;

*

—

\

-

5

8 10 Nombre de cellules grefleesx 10"8

12

Fig. 1. Effets de la greffe sur la population de cellules medullaires. Des poussins de 3 semaines sont irradies puis regoivent une injection de cellules. Apres 6 jours, les animaux sont sacrifices et le nombre de cellules medullaires est compte dans un tibia. Chaque point represente la moyenne plus ou moins l'intervalle de confiance au seuil 5%. 5 repetitions au moins ont ete effectuees dans chaque cas; certaines ont comporte un nombre de repetitions plus eleve, indique au-dessus des points correspondants. # # , Injection de cellules de moelle prelevees sur des animaux de 2,5 mois. Coefficient de regression b = 0,33 + 0,05; O O, injection de cellules de sang d'embryons de 11 jours. Coefficient de regression b = 0,03 ±0,02; •*• ^ injection de cellules de sac vitellin d'embryons de 11 jours. Coefficient de regression b = 0,10 ± 0,04. Pour calculer le nombre de cellules vitellines greffees, on a compte que celles-ci representent 65% de la population cellulaire injectee. Aucune correction n'a ete apportee, dans ce cas, pour tenir compte d'une participation eventuelle a la regeneration medullaire des cellules de sang circulant injectees simultanement.

cellules du sang sera exprimee en pourcentage par le rapport: 100b Ia. Les resultats sont portes dans le Tableau 1. En moyenne, on observe 3 5 % de cellules non vitellines, chiffre qui sera applique dans la suite pour corriger les comptages de cellules vitellines. B. Parametres hematologiques des animaux temoins irradies et non irradies (Tableaux 2 et 3) Les etudes ont ete faites sur des animaux irradies 6 jours auparavant et sur les temoins non irradies d'age equivalent. Au 6eme jour apres la seconde irradiation, les animaux non grerfes presentent

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Fig. 2. Colonies erythrocytaires observees sur la moelle 6 jours apres la greffe. (A) Boudin de moelle fixe et colore montrant les colonies erythrocytaires (grossissement x 30). (B) Frottis effectue au niveau d'une colonie medullaire erythrocytaire (grossissement x 600).

tous les symptomes de l'aplasie. La moelle est peuplee essentiellement d'erythrocytes murs. On y trouve quelques erythroblastes polychromatophiles ages et quelques leucocytes presentant de nombreux signes de degenerescence (aspects pycnotiques; presence d'extrusions cytoplasmiques). Le sang peripherique ne contient aucun erythroblaste polychromatophile; la chromatine des erythrocytes presente un aspect particulierement condense. Sur la moelle des animaux irradies non greffes, on n'observe en general, par tibia, qu'une seule colonie erythrocytaire, au maximum deux colonies. II. Les effets de la greffe La greffe est effectuee dans les 4 heures qui suivent la seconde irradiation et les animaux sont etudies 6 jours plus tard. Les doses d'irradiation utilisees fournissent un taux de mortalite de 80 % au 8eme jour pour les animaux ne recevant pas de greffe ulterieure. Pour les animaux recevant 8 x 1C8 cellules de moelle adulte ou de sac vitellin, ce taux est abaisse a moins de 40 %. A. Nombre des cellules medullaires (Fig. 1) La population cellulaire de la moelle presente une relation lineaire avec la dose de cellules injectees, pour une meme origine des cellules greffees. Si Ton tient compte des cellules medullaires qui subsistent chez les animaux irradies non greffes, la regeneration apparait trois fois plus importante apres greffe d'un


0

267

2 4 6 Nombre de cellules injectees x 10~7 Fig. 3. Effets de la greffe sur le nombre de colonies erythrocytaires medullaires. Des poussins de 3 semaines sont irradies puis recoivent une injection de cellules. Apres 6 jours, les animaux sont sacrifies et le nombre de colonies medullaires est compte a la surface de la moelle d'un tibia. Chaque point represente la moyenne plus on moins l'intervalle de confiance au seuil 5 %. Chaque mesure a ete repetee 5 fois au moins; dans les cas ou un nombre plus eleve de repetitions a ete effectue, celui-ci est indique au-dessus des points correspondants. • • , Injection de cellules de moelle prelevees sur des animaux de 2,5 mois. Coefficient de regression b = 22,1 x 10~7±2,8x 10~7; O O, injection de cellules de sang d'embryons de 11 jours. Coefficient de regression b = 2,2 x 10~7±0,3x 10~7; • • , injection de cellules de sac vitellin. En comptant le nombre de cellules vitellines de la meme facon que sur la Fig. 1 et sans tenir compte de la regeneration due aux cellules du sang greffees simultanement, on calcule un coefficient de regression b = 8,lxlO" 7 ± 1,8 x 10"7. La valeur de b peut etre corrigee apres deduction des effets dus aux cellules du sang: b corrige = 6,8 x 10~7 ± 1,5 x 10"7.

268

J. SAMARUT ET V. NIGON Tableau 4. Mesure du rendement de la grejfe apres injection de cellules de moelle adulte ou de sac vitellin d'embryons de 11 jours Origine des cellules greffees

Frequence apparente des CFU dans les preparations injectees = /?„ Nombre de cellules injectees aux receveurs primaires = Nx Nombre de colonies par tibia chez les receveurs secondaires = N2 Rendement de la greffe = /

Moelle de 2,5 mois 7

Sac vitellin 7

21,2 x 10~ ± 5,6 x 10~

4,4 x 10~7 ± 1,0 x 10~7

2 x 108

5 x 108

20,8 ± 2,6

5,0 ±1,5

0,049 ± 0,007

0,023 ± 0,013

Des poussins de 3 semaines irradies recoivent une injection de A^ cellules. Deux heures plus tard, les tibias de ces receveurs primaires sont preleves et la totalite de la moelle d'un tibia est injectee a un poussin receveur secondaire. Le nombre de colonies chez ces receveurs secondaires est mesure 6 jours apres l'injection. La frequence apparente des CFU dans les preparations injectees est determined, apres injection a des poussins de 3 semaines irradies, par le rapport entre le nombre de colonies par tibia mesure au 6eme jour et le nombre de cellules injectees.

nombre donne de cellules lorsque celles-ci sont issues de la moelle d'un animal adulte que lorsqu'elles proviennent du sac vitellin. Les pentes des droites sont significativement differentes l'une de l'autre (P < 0,01). Apres greffe de sang d'embryon, la regeneration est faible, mais la presence, dans la moelle, de cellules erythrocytaires et granulocytaires tres jeunes laisse supposer l'existence d'une colonisation effective. B. Nature et frequence des diverses cellules medullaires {Tableau 2) L'extreme pauvrete de la moelle des animaux greffes avec du sang d'embryon n'a pas permis l'etablissement de myelogrammes valables pour ces animaux. Apres greffe de cellules de moelle adulte ou de cellules de sac vitellin, plus de 90 % des cellules issues du greffon appartiennent a la lignee erythrocytaire et sont representees en majorite par des erythroblastes polychromatophiles. La transformation de la moelle affecte aussi les autres lignees hematopoietiques mais on observe des differences selon l'origine du greffon. La population granulocytaire est relativement plus importante apres greffe de cellules de sac vitellin qu'apres greffe de cellules de moelle. La situation inverse est observee pour les cellules lymphocytaires et monocytaires. La regeneration apres greffe est caracterisee par des index de mitose superieurs a celui observe dans la moelle normale (Tableau 3). C. Colonies medullaires erythrocytaires Apres la greffe d'un nombre reduit de cellules (106 a 5 x 107 cellules de moelle), la regeneration de l'erythropoiese medullaire est localisee au niveau d'ilots erythropoietiques bien individualises, visibles a la surface de la moelle (Fig. 2 A). Des frottis effectues apres prelevement de ces ilots montrent une

Tissus hematopoietiques injectes a des poussins irradies

0

2 4 6 8 10 Nombre de cellules greffees x 10~8

269

12

Fig. 4. Effets de la greffe sur la population des erythroblastes polychromatophiles du sang circulant. Des poussins de 3 semaines sont irradies puis regoivent une injection de cellules. Apres 6 jours, le taux d'erythroblastes polychromatophiles sanguins est determine sur frottis. Chaque point represente un pourcentage moyen accompagne de son intervalle de confiance au seuil 5%, excepte pour les pourcentages tres faibles inferieurs a 0,2 %. Chaque mesure comporte 5 repetitions au moins. Certaines mesures reposent sur un nombre de repetitions plus eleve, indique au-dessus des points correspondants. • • , Injection de cellules de moelle prelevees sur des animaux de 2,5 mois. Coefficient de regression b = 3,4 x 10~ n ; O O> injection de sang d'embryons de 11 jours. Coefficient de regression b = 0,4 xlO~ u ; • *, injection de cellules de sac vitellin d'embryons de 11 jours. Coefficient de regression b = 7,0 x 10~u. Le nombre de cellules vitellines injectees a ete calcule de la meme facon que sur la Fig. 1. Aucune correction n'a ete apportee dans ce cas pour tenir compte d'une participation eventuelle a la regeneration medullaire des cellules du sang circulant injectees simultanement. moelle riche, peuplee exclusivement de cellules erythrocytaires plus ou moins jeunes dans un etat de synchronisme remarquable (Fig. 2B). Ces observations contrastent avec celles eflfectuees dans les zones situees entre les colonies, ou la moelle presente un aspect tres pauvre, identique a celui des moelles des temoins irradies. Pour une meme origine des cellules grefTees, le nombre de colonies par tibia observe 6 jours apres la greflfe presente une relation lineaire avec la dose de cellules injectees (Fig. 3). On peut considerer que chaque colonie ainsi observee

270


resulte du developpement d'une seule cellule souche erythrocytaire que nous nommerons CFUEm ('colony forming unit' erythropoietique medullaire). D. Rendement de la greffe. Estimation de la 'frequence reelle' des CFUEm Les pentes des droites de la Figure 3 permettent de calculer une 'frequence apparente' des CFUEm representant le rapport entre le nombre total de cellules injectees et le nombre de colonies trouvees au niveau d'un seul tibia. Ces 'frequences apparentes' peuvent etre transformers en 'frequences reelles' en tenant compte du rendement de la greffe (voir Materiel et Methodes). Si n0 est la 'frequence apparente' des CFU dans les preparations injectees, Nx le nombre de cellules injectees aux poussins receveurs primaires et N2 le nombre de colonies observe chez les poussins receveurs secondaires, la valeur du rendement de la greffe, / , est donnee par la relation

Les resultats sont portes dans le Tableau 4. Le rendement de la greffe est de 4,9 % apres greffe de moelle adulte et de 2,3 % apres greffe de cellules vitellines. Les frequences reelles des cellules souches, estimees a partir des pentes des droites de la Figure 3, sont done 300 CFU pour 107 cellules dans le sac vitellin et 450 CFU pour 107 cellules dans la moelle adulte. E. Erythropo'iese au niveau du sang circulant Des erythroblastes polychromatophiles apparaissent dans le sang des animaux greffes a partir du 5eme jour qui suit la greffe. Au 6eme jour, le taux de ces cellules affecte une relation lineaire avec la dose des cellules greffees, pour des cellules d'une meme origine (Fig. 4). Pour des nombres equivalents de cellules injectees, on observe, apres la greffe de sac vitellin, environ deux fois plus d'erythroblastes polychromatophiles sanguins qu'apres greffe de moelle. Une erythropoiese non negligeable est observee apres l'injection de sang embryonnaire. Nous avons verifie que le volume sanguin et le nombre de cellules erythrocytaires par mm3 de sang ne sont pas modifies de facon sensible quel que soit le type de greffe (Tableau 3). Les differences observees au niveau des taux d'erythroblastes polychromatophiles ne peuvent done pas etre attribuees a des differences dans le nombre de cellules erythrocytaires du sang. III. Production des colonies erythropoietiques {Tableau 5) L'etude de la production des colonies erythropoietiques necessite l'injection d'un grand nombre de cellules conduisant a une confluence des colonies dont le denombrement n'est plus possible. Dans ces conditions, on ne peut verifier la linearite de la relation entre le nombre de cellules injectees et le nombre de colonies formees. Si nous supposons que cette linearite est conservee jusqu'a

Tissus hematopoietiques


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Tableau 5. Nombre de cellules produites a partir d'une cellule souche fixee par tibia au 6eme jour apres greffe de cellules de diverses origines Greffe de Greffe de sac vitellin sang d'embryons de d'embryons de 11 jours 11 jours Frequence, dans la preparation injectee, 6,8 x 10~7 ± des CFUEm susceptibles de se fixer 1,5 x 10~7 dans un tibia Nombre total de CFUEm implantees par 544 ± 120 tibia apres injection de 8 x 108 cellules Nombre de cellules medullaires produites 14,7 x 104 a partir d'une CFUEm implantee par tibia* Nombre d'erythroblastes polychromato287 x 104 philes presents dans le sang pour une CFUEm implantee par tibiaf Nombre de proerythroblastes et erythro1,10 x 10* blastes basophiles dans la moelle, produits a partir d'une CFUEm implantee par tibia} Nombre d'erythroblastes polychromato10,1 x 104 philes dans la moelle, produits a partir d'une CFUEm implantee par tibia§

Greffe de moelle de 2,5 mois

2,2xl0- 7 ± 0,3 x 10-7

22,lxl0- 7 ± 2,8 x 10~7

176 ±24

1760 ±220

13,6 xlO4

14,8 x 10*

28,4 xlO4

34,0 x 104

1,3 xlO4

7,1 x 104

* Calcule par le rapport des pentes des Figures 1 et 3. t Calcule par le rapport entre le nombre d'erythroblastes polychromatophiles dans le sang et le nombre de CFUEm implantees par tibia apres greffe de 8 x 108 cellules. X Calcule par le rapport entre le nombre de proerythroblastes et erythroblastes basophiles presents dans la moelle et le nombre de CFUEm implantees par tibia apres greffe de 8 x 108 cellules. § Calcule par le rapport entre le nombre d'erythroblastes polychromatophiles presents dans la moelle et le nombre de CFUEm implantees par tibia pour 8 x 108 cellules greffees.

109 cellules injectees, on peut calculer le nombre de CFUEm fixees dans un tibia pour 8 x 108 cellules greffees (Tableau 5, ligne 2). A partir de la, en rapprochant les Figs. 1 et 3, on peut calculer la production de cellules medullaires par CFUEm en 6 jours (Tableau 5, ligne 3). Noter que, dans ce cas, un facteur correctif devrait etre introduit pour tenir compte des cellules detruites inevitablement au cours de la dilaceration de la moelle. Si y est la proportion des cellules non detruites, le facteur correctif doit etre \jy. On peut admettre que la valeur de ce facteur est constante au cours des experiences, ce qui permet de comparer les divers resultats en valeurs relatives: on constate que les valeurs obtenues sont peu differentes quelle que soit l'origine des cellules greffees. Les memes remarques doivent etre faites pour la production, par CFUEm, de proerythroblastes et erythroblastes basophiles et pour celle d'erythroblastes polychromatophiles presents dans la moelle (Tableau 5, lignes 5 et 6).

272


Si Ton veut etablir des calculs similaires pour les erythroblastes polychromatophiles du sang, on doit tenir compte du fait que ceux-ci sont produits au niveau de l'ensemble des sites medullaires. Les chiffres portes a la ligne 4 du Tableau 5, ramenant la production d'erythroblastes polychromatophiles du sang au nombre de CFU fixees dans un seul tibia, devront done etre corriges par un facteur x representant la proportion des CFU fixees dans un tibia par rapport au nombre total des CFU fixees dans l'ensemble des sites medullaires. L'intervention de ce facteur, etant identique dans les diverses conditions experimentales, n'interdit pas la comparaison. On observe alors que les valeurs trouvees ne sont pas significativement differentes que Ton injecte du sang d'embryon ou de la moelle adulte. En revanche, l'injection de cellules du sac vitellin fournit une valeur environ huit fois plus elevee au 6eme jour. Le rendement de la greffe, mesure sur un seul tibia, represente en fait le produit de la fraction des CFU fixees dans un tibia (par rapport a l'ensemble des CFU fixees dans tous les sites medullaires) par un facteur de viabilite des CFU. Le rendement maximum observe represente done en fait la valeur minimale possible de x et Ton aboutit a la conclusion que x > ^ . DISCUSSION

1. Origine des colonies erythropo'ietiques L'existence de colonies hematopoietiques dans la moelle d'animaux irradies et greffes a deja ete decrite chez la souris (Wolf & Trentin, 1968). Nous avons raisonne, dans Interpretation de ces resultats, par homologie avec les interpretations, desormais classiques, employees pour rendre compte de la formation de colonies spleniques apres injection de cellules souches a des souris irradiees (Till & McCulloch, 1961). L'interpretation des colonies medullaires observees en tant que clones cellulaires peut s'appuyer sur deux arguments. D'une part, toutes les cellules d'une meme colonie manifestent un synchronisme remarquable dans leur structure. D'autre part, le nombre moyen des colonies obtenues evolue lineairement en fonction du nombre de cellules injectees, lorsque celles-ci proviennent d'une meme origine. Ce dernier argument doit cependant etre considere avec precaution car la variability des mesures est elevee et serait eventuellement compatible avec une interpretation non lineaire. Celle-ci represente, en tout etat de cause, l'hypothese la plus simple, a considerer en premier lieu. Une hypothese non lineaire conduirait a supposer, par exemple, l'intervention d'une saturation susceptible d'inflechir le graphique vers le bas pour les valeurs les plus elevees des nombres de cellules injectees. Une telle eventualite conduirait a modifier certaines valeurs du Tableau 5, comme il a ete signale plus haut.

Tissus hematopo'ietiques


273

2. Taux de production de cellules erythrocytaires a partir des cellules souches Comme principal critere de production, nous retiendrons le nombre des erythroblastes polychromatophiles. Ce nombre peut donner un indice valuable a condition d'admettre que la duree de vie de ces cellules dans le sang circulant est identique, quelle que soit Porigine des cellules souches. En admettant cette hypothese, on constate que la production d'erythroblastes polychromatophiles par colonie est la meme, que les cellules souches aient ete fournies par du sang d'embryon ou par de la moelle d'adulte. Au contraire, les cellules souches du sac vitellin paraissent dotees d'une activite productrice beaucoup plus elevee. La difference observee selon l'origine des cellules injectees peut etre interpretee en faisant appel a l'une ou l'autre des deux hypotheses suivantes: Ou bien Perythropoiese declenchee par Pinjection de cellules vitellines se deroule uniquement dans les sites medullaires. II faudrait admettre alors qu'elle comporte des constantes cinetiques de valeurs differentes de celles qui sont obtenues apres injection de cellules de sang d'embryon ou de moelle d'adulte. Ou bien Perythropoiese consecutive a Pinjection de cellules de sac vitellin s'effectue dans deux categories de sites distinctes. Les sites medullaires pourraient alors fonctionner avec les memes parametres cinetiques que lorsqu'ils sont peuples de cellules issues du sang d'embryon. L'autre site pourrait repondre a des caracteristiques differentes. Les donnees actuellement recueillies ne permettent d'exclure aucune de ces deux hypotheses. La premiere permet d'autres evaluations de sorte que nous en examinerons les consequences plus en detail. 3. Calculs sur un modele 3.1. Construction du modele Pour edifier un modele, nous formulons des hypotheses schematisees dans la Fig. 5. (1) Les cellules souches greffees se developpent uniquement dans les sites medullaires. (2) Une cellule souche initiate se divise regulierement au cours de i cycles de division a Pissue desquels elle donne naissance a un nombre N.t (= 21) de cellules similaires a elle-meme. (3) A partir de la /feme generation, et a chacune des generations suivantes, une proportion q des cellules souches presentes va se differencier en 'cellules meres d'erythrocytes'. Le nombre de ces cellules meres a la ibme generation est alors E( = qN{. Les cellules souches restantes (soit Nt — E^) continuent a se diviser et a se differencier, pendant un nombre de generations indefini, selon des regies constantes. (4) Les cellules meres des erythrocytes subissent un nombre limite, n, de divisions cellulaires. Nous supposons que le temps de generation de ces cellules est identique a celui des cellules souches.

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Fig. 5. Modele schematique representant la production de cellules erythropoietiques a partir d'une cellule souche. O, Cellule souche capable de se multiplier indefiniment; • , cellule mere des erythrocytes dont la multiplication est limitee a n cycles; ®, erythroblaste incapable de se multiplier; *, erythrocyte mur; , division cellulaire; , maturation sans division cellulaire. /, n, v, nombres de generations.

(5) A Tissue de la nhmG division, les cellules meres se transforment en erythroblastes polychromatophiles qui ne se divisent plus. Ceux-ci survivent sous cette forme, dans la moelle ou dans le sang circulant, pendant une duree qui est egale a celle de v cycles de division des cellules souches. Us se transforment ensuite en erythrocytes murs. A un instant determine, le nombre total de polychromatophiles presents et issus d'une cellule souche initiale est Pt. Lorsque le nombre m de generations cellulaires parcourues apres la greffe est superieur ou egal a i+n + v, il s'etablit un regime pour lequel on peut calculer la frequence theorique des diverses categories de cellules issues d'une meme cellule souche. Ainsi, a la nfmG generation cellulaire on demontre que le nombre total

Tissus hematopoietiques injectes a des poussins irradies

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Tm de cellules capables de se multiplier ( = cellules souches + cellules meres des erythrocytes) est: Tm = 2 wl (l-g) m-n -* +1 . Au meme moment, le nombre total d'erythroblastes polychromatophiles presents est: Pm = 2—^(1-?)™—»- * 2* [2(1-$)]*.