Purification and derivatization of secondary metabolites from plants

73 downloads 0 Views 375KB Size Report
Separation of each desired class of compound from crude plant extract is a difficult task for their identification and purification. Therefore it is essential to have ...
Home

Contact us

Login

  Search

.

you are here­>home­>biotechnology and biomedical engineering­>plant metabolic pathways virtual laboratory­>purification and derivatization of secondary metabolites from plants

.

.

Purification and derivatization of secondary metabolites from plants

.

.

.....

Theory 

Procedure 

Self Evaluation 

Reference 

       

INTRODUCTION  

The natural products obtained from plants either as pure compounds or standardized extract provides a unique opportunity for the development of new drugs due to their complex nature.  

The  increasing  needs  for  the  isolation  and  purification  of  bioactive  compounds  from  crude  plant  extracts  leads  to  the  development and advancement in separation techniques and instrumentation.  

Plant extract usually occurs in a combination of different classes of compounds or phyto­chemicals with different solubility’s.  

The  compounds  which  are  isolated  from  different  natural  plant  sources  by  using  various  solvent  systems  and  chromatographic techniques  is  very  important,  but  obtaining  that  compounds  in  a  pure  state  can  be  a  difficult  and  time  consuming  step  in  natural products research.  

Separation  of  each  desired  class  of  compound  from  crude  plant  extract  is  a  difficult  task  for  their  identification  and  purification.  Therefore  it  is  essential  to  have  efficient  chemical  and  biological  screening  systems  for  rapid  investigations  of  the  plant  extracts. Practically most of them have to be purified by the combination of several chromatographic techniques.  

A  number  of  sophisticated  separation  techniques  have  been  used  in  the  recent  past  such  as  Thin  Layer  chromatography  (TLC), Column chromatography, Flash chromatography and High Performance Liquid Chromatography (HPLC) to obtain the pure compound from mixture of compounds in the plant extract.  

The  purification  strategy  always  comprises  a  multistep  procedure  including  extraction,  pre­purification  and  then  one  or  several chromatographic steps. Thus the fresh or dry sample will be cut up or ground to a powder before­                                                                          1. extraction with organic solvents (perhaps in a sequence of increasing polarity)                            2. water or supercritical CO2 solvent partitions to remove less polar or more polar compound                                                3. purification by TLC and HPLC 

                                              By  employing  purification  techniques  one  can  say  that  the  purification  process  is  over  and  the  compounds  achieved  is  absolutely pure.  But  it  doesn’t  mean  that  the  compound  obtained  is  free  of  other  chemicals  instead  it  can  be  quoted  that  the  amount  of  any impurity present doesn’t exceed the acceptance level.  

In general the main objective during isolation of natural polyphenols from complex plant extracts is to obtain compounds in sufficient quantities and with high purities for structural elucidation, for further use in bioactivity studies.     

PURIFICATION METHODS  

Multistep  purification  procedures  may  sometimes  result  in  drastic  sample  or  activity  loss  during  the  isolation  of  target  compounds because of sample degradation, irreversible adsorption on solid support or dilution.  

The purification stage includes removing the interfering compounds from the crude extract with partitionable solvents and using open column chromatography or an adsorption­ desorption process.  

Sephadex  LH­20,  Polyamide,  Amverlite,  Solid  phase  extraction  cartridges  and  styrene­divinyl  benzene  (XAD­4,  XAD­16,  EXA­90, EXA­118, SP­70), acrylic resins (XAD­7, EXA­31) are examples of regularly applied materials to purify phenolics from crude sample extracts.  

SPE is widely used for pre­concentration and clean up of analytical samples and purification of medicinal plant extracts. This method offers a variety of solvents based mainly on silica. Liquid­ liquid extraction is based on partition between

solvents  is  the  most  commonly  preparative  purification  method  where  a  large  proportion  of  extraneous  constituents need to be removed.     

TECHNIQUES USED FOR PURIFICATION    

Flash chromatography is mainly used for rapid fractionation of crude extracts or coarsely purified extractions. This technique can be used  with  silica  column  or  reverse  phase­18  columns  for  final  purification  of  crude  extracts.  So,  a  purification  method  should  be employed to purify individual isolated compound from the crude plant extract.  

Sephadex LH­20 is a liquid chromatography medium, which is beaded, cross linked dextran, and has been hydroxypropylated for the matrix to be both hydrophilic and lipophilic in nature. Sephadex LH­20 is useful for clean up and had also been used for the separation of  compounds  such  as  condensed  tannins,  catechin,  and  fractionation  of  proanthocyanidins  and  also  for  other  phenolic  compounds. Further Sephadex G­25 and G­50 which are generally used in gel filtration chromatography have also been used for the purification of phenolic compounds and fractionation as well.  

HPLC is routinely used in phytochemical extractions to optimize the experimental conditions and to check the purity of the final isolated compound. The combination of columns used and solvent system has been widely employed and useful for the study of polyphenolic compounds.  Preparative  HPLC  is  a  purification  process  which  aims  at  isolation  of  a  pure  compound  from  a  mixture.  During  the separation of the compounds by analytical HPLC, we consider important parameters such as resolution, sensitivity and time while during preparative HPLC degree of the solute purity is considered most. However in most of the cases semi­preparative and preparative HPLC with higher peak resolution power had to be applied for final purification.   

Tea,  Maize  and  Petunia  are  known  to  be  rich  in  polyphenolic  compounds.  Therefore,  the  detailed  protocol  for  purifying  the compounds from these plant systems has been provided in procedure.  

A basic method for purifying Catechins from Tea plant is shown in Fig 1    

     

DERIVATIZATION  

Derivatization is the process of chemically modifying a compound to a new product with same chemical structure called derivative that are suitable for the analysis using GC or HPLC.  

The  main  aim  of  this  method  is  to  modify  the  functional  groups  of  the  reacting  compound  so  that  it  can  be  easily  detectable  and systematically analyzed.  

The process allows enhancing the chromatographic qualities by fixing the chemical and physical properties of the analyte to get better volatility and more importantly lower polarity of the derivatized adduct.

 

The use of derivatization process during sample extraction can be simply and friendly to automated throughput for sample analysis. Further  the  derivatization  step  can  be  carried  out  before  in  combination  with  or  after  sample  pre­treatment  and  can  be  used  for different analytes.  

During the analysis no interference of excess reagents should be present and they should be removed easily. Further care should be taken that no additional impurities are present during analysis and the reaction must be quantitative.   

The selection of appropriate derivatization reaction depends on­  

                                          1. Nature (polar, non­polar) and stability of the compounds to be extracted.                                           2. Nature of the solvent use.                                           3. Reaction conditions maintained during extraction.  

Advantages of Derivatization  

                       1.Increases volatility                                2. Eliminates the presence of polar OH, NH and SH groups                                3. Increases stability and detectability                                4.Reduces the adsorption of polar samples on active surfaces of column walls.  

Derivatization reactions are needed in GC and HPLC. The aim of derivatization reactions for use with GC analysis is to improve peak symmetry, resolution, selectivity and sensitivity of the analytes and their thermal stabilities.  

Usually analytes are converted by derivatization either into volatile compounds able to be analyzed by GC with sensitive detectors. The derivatization technique generally consists of substitution of the active H2 atom in –NH, ­ COOH, ­OH or –SH using alkylation, acylation or silylation reactions.     

a)  Silylation:  Silylation  is  the  most  common  derivatization  technique  used  in  the  conversion  of  the  analyte  to  its  trimethylsilyl derivative.          Examples of silylation for functional groups are listed below: .....

.....

     

   

It is the most prevalent derivatization process which volatizes the sample readily.   

They react with water and alcohol and produces silyl derivatives which are volatile. They replace active hydrogens with TMS (trimethyl silyl groups).  

Nearly all functional groups which present a problem in gas chromatographic separation (hydroxyl, carboxylic acid, amine, thiol, phosphate) can be derivatized by silylation reagents.    

The derivatives of the silylation reactions are generally less polar, more volatile and more thermally stable.    

The introduction of a silyl group(s) can also serve to enhance mass spectrometric properties of derivatives, by producing either more  favorable  diagnostic  fragmentation  patterns  of  use  in  structure  investigations,  or  characteristic  ions  of  use  in  trace analyses in other related techniques.    

b) Alkylation:  This method replaces active hydrogen with alkyl groups thereby reducing molecular polarity. They make esters, ethers, alkyl amides and alkylamines. Reagents commonly used are acidified methanol, boron trichloride and boron trifluoride in methanol or butanol.    

c) Acylation:  It  reduces  the  polarity  of  the  reactive  functional  groups  such  as  amino,  hydroxyl  and  thiol  groups.  The  acylating reagents targets highly polar, multifunctional compounds such as carbohydrates and amino acids. Commonly used reagents are – acetic anhydride, TFA etc.

   

 

d)  Chiral  Derivatization:  The  reagents  used  in  this  method  target  one  specific  functional  group  and  produce  individual diastereomers  of  each  of  the  enantiomers.  Enantiomers  can  be  separated  in  chromatography  by  allowing  separation  on  an optically active stationary phase.  

Pre­column  derivatization  involves  the  reaction  of  the  analyte  of  interest  with  a  reagent  and  performs  sample  clean  up  before chromatographic separation and detection are carried out.  

When  derivatization  of  analytes  is  performed  prior  to  loading  the  sample  into  GC  or  LC  column,  this  mode  is  called  pre­column derivatization. The post­ extraction derivatization type is the most common used. Once the extract has been obtained, it’s derivatized before chromatographic analysis.  

Derivatization mode can be considered:­  

                                1. Off­line derivatization using manual direct addition of the derivatization  reagent to sample extract in a fume hood                                       2. On­line derivatization, as an attractive alternative to manual derivatization because it avoids preparative steps accelerates reaction rates and reduces evaporation losses.    

Post column derivatization is carried out after the separation of components. For post column mode, derivatization takes place only after the analytes are separated in GC or LC columns they are then converted to a form more amenable to detection.  

Derivatization  is  affected  by  some  drawbacks  such  as  complexity,  loss  and  contamination  of  analytes  and  time  consuming. Sometimes the derivatization is carried out after chromatographic separation and before the final detection in order to increase the selectivity and sensitivity of determinations.    

      

Fig 3: Derivatization Strategies in Sampling/Extration Techniques  

Cite this Simulator: iitkgp.vlab.co.in,. (2015). Purification and derivatization of secondary metabolites from plants. Retrieved 22 September  2016, from iitkgp.vlab.co.in/?sub=79&brch=262&sim=1417&cnt=1  Copyright @ 2016 Under the NME ICT initiative of MHRD (Licensing Terms)  Powered by AmritaVirtual Lab Collaborative Platform [ Ver 00.6.9 ]