Removal of damaged proteins during ES cell fate specification ...

3 downloads 586 Views 803KB Size Report
Supplementary information for the manuscript. Removal of damaged proteins during ES cell fate specification ... Figure S3. The 19S regulator does not bind 20S ...
Supplementary information for the manuscript

Removal of damaged proteins during ES cell fate specification requires the proteasome activator PA28 Malin Hernebring, Åsa Fredriksson, Maria Liljevald, Marija Cvijovic, Karin Norrman, John Wiseman, Henrik Semb, Thomas Nyström  

b

20 nM Epoxomicin

c 100

100

% viable cells

Relative #cells

a

50

0 20 nM Epoxomicin

50

0 20 nM Epoxomicin

Figure S1. Effect of 20 nm epoxomicin on differentiating ES cells. (a)  Cleaved Caspase‐3 (in red; detected by IHC using rabbit anti‐cleaved  caspase‐3, 1:1000 from R&D Systems; and donkey anti‐rabbit A594, 1:500  from Molecular probes, Invitrogen) and DAPI (blue) in epoxomicin treated  and differentiated (3 days) ES cells (left). An apoptotic cells is shown to  the right (caspase‐3 localized to the nucleus). (b‐c) Effect of 20nM  epoxomicin treatment on the growth rate (b) and viability (c) of  differentiating ES cells presented as the relative number of cells per plate  after 3 days of subsequent differentiation and proteasome inhibition. The  number of cells on the untreated plates was set to 100% in (b), while the  percentage of viable cells on the plates is presented in (c). Cell number  and viability were both estimated using Countess® Automated Cell  Counter (Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. Error  bars represent SEM (n=3).

Days of differentiation 0

3

5

0

3

5

0

3

5

kDa 50 37

25 20

15 β5i detection

β5 detection

Figure S2. β5 and β5i are processed (around 23 kDa rather than 28‐30kDa) suggesting that β5i is  incorporated into the 20S. SDS‐PAGE followed by  Western blot of β5i (middle blot and in red in the  merged blot to the left) and β5 (right blot and in green  in the merged blot to the left) in undifferentiated and  differentiated ES cells. Neither the β5 nor the β5i blots  displayed a 28.5kDa1 or 30kDa2 protein band which  would correspond to their unprocessed form.

References Figure S2 1.

2. 

Früh, K. et al. Alternative exon usage and processing of the major histocompatibility  complex‐encoded proteasome subunits. Journal of Biological Chemistry 267, 22131‐ 22140 (1992). Frentzel, S., Pesold‐Hurt, B., Seelig, A. & Kloetzel, P.‐M. 20 S proteasomes are  assembled via distinct precursor complexes processing of LMP2 and LMP7 proproteins takes place in 13–16 S preproteasome complexes. J Mol Biol 236, 975‐981 (1994).

Days of differentiation 0

3

5

0

3

5

0

3

5

α7 (20S) detection Rpn7 (19S) detection

Figure S3. The 19S regulator does not bind 20S during  PA28‐20S favouring conditions. Native gel blot of  samples extracted and run to optimize PA28‐20S  interaction. The red signal corresponds to detection of  Rpn7 (19S subunit) and green to α7 (20S subunit). The  blot in the middle displays the α7 signal alone and the  blot to the right Rpn7 alone.

1.0

0.5

miRNA: lacZ

Luc

PA28α

Figure S4. miRNA targeting PA28α does not affect the levels of protein carbonyls in undifferentiated ES cells. Levels of  carbonylated proteins in undifferentiated  ES cells treated with miRNA targeting  PA28α and the non‐targeting controls lacZ and Luc. 24 h after electroporation,  blasticidin was added to the ES medium  containing LIF and the cells were subjected  to 4 days of selection. The mean value was  set to 1.0 and error bars represent SEM  (n=3).



 

 

                 b 

  Figure  S5.  Supplementary  information  of  statistical  analysis  of  figure  1a.  “df0”  denotes  undifferentiated  cells,  “df3”  cells  that  have  been  differentiating  for  3  days,  and  “df5”  cells  after  5  days of differentiation. (a) Boxplot of the carbonyl levels during differentiation (y‐axis relative levels  of protein carbonyls, x‐axis different days of differentiation). (b) Plot visualizing a post hoc Tukey test  (y‐axis: 3 analysed groups: df3‐df0, df5‐df0 and df5‐df3; x‐axis: difference in mean levels of Days of  differentiation  (DF)).  An  analysis  of  variance  (ANOVA)  yielded  significant  variation  among  different  groups of days of differentiation (F(2,7)=23.367, p=.00079). A post hoc Tukey test showed significant  difference at p