SUPRASPINAL ACTIONS OF PENTOBARBITAL ON

 

SUPRASPINAL ACTIONS OF PENTOBARBITAL ON TRANSMISSION  THROUGH THE SPINOTHALAMIC TRACT   by  Dhananjay Namjoshi  M. Pharm, University of Mumbai, 2003  B. Pharm, University of Mumbai, 1999    A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF  THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF    MASTER OF SCIENCE  in  The Faculty of Graduate Studies  (Pharmaceutical Sciences)    THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA  December 2007  © Dhananjay Namjoshi, 2007 

 

ABSTRACT   

Despite  the  advances  made  in  our  understanding  of  the  molecular  mechanistic  actions  of  general anesthetics very little is known about the in vivo neural circuits involved in creating  the state of general anesthesia. To date the common consensus is that general anesthetics act  ubiquitously  within  the  CNS.  Recently,  (Devor  and  Zalkind,  2001)  have  reported  that  microinjections  of  pentobarbital  (PB)  into  a  discrete  brainstem  focal  area  of  conscious  rats  induced  a  classical,  reversible  general  anesthesia‐like  behavioral  state.  The  authors  concluded  that  this area,  termed the  mesopontine tegmental  anesthesia area  (MPTA), may  be important for the induction of general anesthesia. The purpose of the present project was  to  study  the  neurophysiological  basis  of  the  analgesia,  which  accompanied  the  state  of  general  anesthesia  induced  by  PB  microinjections  into  the  MPTA  that  was  reported  by  (Devor and Zalkind, 2001). Here, sensory inflow via the spinothalamic tract (STT), a classical  spinal  nociceptive  pathway  in  the  rat,  was  assessed  using  single  neuron  extracellular  recording techniques before, during and after microinjections of PB into the MPTA.  

Spontaneous firing rate (SFR), antidromic firing index (FI) and sciatic as well as sural  nerve‐evoked  responses  (Sc‐,  Su‐ER)  of  STT  neurons  in  isoflurane‐anesthetized  rats  were  quantified before as well as 2, 15, 30 and 60 min following bilateral microinjections of either  PB (200 μg/side) or vehicle control solution (Vh, 1 μL/side) into the MPTA.  

The  group  mean  SFR,  FI  as  well  as  magnitudes  of  Sc‐,  Su‐ER  of  STT  neurons  were  significantly  and  reversibly  reduced  following  PB  microinjections  compared  to 

 

ii  

  corresponding baseline measurements. There were no significant changes in any of the three  parameters  following  microinjections  of  Vh  compared  to  the  pre‐microinjection  baseline  responses.  

The  results  from  this  study  indicate  that  analgesia,  which  occurs  during  the  anesthesia‐like  state  following  microinjections  of  PB  into  the  MPTA,  may  be  due  to  attenuation  of  sensory  inflow  through  the  STT.  The  suppression  of  STT  neurons  likely  occurs  via  direct  and/or  indirect  descending  pathways  from  the  MPTA  to  the  spinal  cord.  This study provides the first direct electrophysiological evidence for the analgesia caused by  PB microinjections into the rat MPTA. 

 

 

iii  

 

TABLE OF CONTENTS  ABSTRACT......................................................................................................................................... ii  TABLE OF CONTENTS .................................................................................................................. iv  LIST OF TABLES............................................................................................................................viii  LIST OF FIGURES ............................................................................................................................. x  LIST OF SYMBOLS AND ABBREVIATIONS ...........................................................................xv  ACKNOWLEDGEMENTS.............................................................................................................xix  DEDICATIONS ...............................................................................................................................xxi  CHAPTER 1: GENERAL INTRODUCTION................................................................................. 1  1.1. Mechanism(s) of Actions of General Anesthetics: From Lipid to Protein Theory...... 2  1.2. Central Sites of General Anesthetic Actions...................................................................... 3  1.3. Mesopontine Tegmental Anesthesia Area: Potential Central Site for the Induction  of General Anesthesia .......................................................................................................... 4  1.4. The Spinothalamic Tract ........................................................................................................ 9  1.5. Study Rationale...................................................................................................................... 10  1.6. Research Hypothesis............................................................................................................. 12  1.7. Research Objectives .............................................................................................................. 12  CHAPTER 2: MATERIALS AND METHODS............................................................................ 16  2.1. SURGICAL PROCEDURES ................................................................................................ 16  2.1.1. Anesthetic Induction......................................................................................................... 16  2.1.2. Tracheotomy ....................................................................................................................... 18  2.1.3. Sciatic and Sural Nerve Surgery ..................................................................................... 19  2.1.4. Thoracolumbar Laminectomy ......................................................................................... 19  2.1.5. Craniotomy.......................................................................................................................... 20   

iv  

  2.1.6. T13‐L1 Vertebral Immobilization Procedures ................................................................ 21  2.2. EXTRACELLULAR RECORDING PROCEDURES ........................................................ 22  2.2.1. Antidromic Identification of Spinothalamic Tract (STT) Neurons ......................... 22  2.2.2. Electroencephalogram....................................................................................................... 24  2.2.3. Spike Amplification, Recording and Data Acquisition Procedures ........................ 25  2.2.4. Baseline Electrophysiological Recording Procedures................................................. 26  2.2.4.1. Spontaneous Spike Activity .................................................................................. 26  2.2.4.2. Antidromic Firing Index......................................................................................... 27  2.2.4.3. Peripheral Nerve Stimulation‐Evoked STT Responses ................................... 28  2.3. DRUG AND CONTROL SOLUTIONS ............................................................................ 29  2.4. INTRACEREBRAL MICROINJECTIONS PROCEDURE............................................. 30  2.5. DRUG/VEHICLE CONTROL‐RESPONSE STUDIES ................................................... 32  2.6. BRAIN PERFUSION AND HISTOLOGY ........................................................................ 34  CHAPTER 3: RESULTS ................................................................................................................... 39  3.1. SPINOTHALAMIC TRACT NEURONS: GENERAL CHARACTERISTICS............ 40  3.2. STUDIES OF THE ELECTROPHYSIOLOGICAL PARAMETERS ............................. 44  3.2.1. Three Groups of Spinothalamic Tract Neurons According to the Treatment  Protocol............................................................................................................................... 45  3.2.2. ELECTROPHYSIOLOGICAL PARAMETERS AT THE BASELINE ....................... 48  3.2.2.1. Spontaneous Firing Rate ........................................................................................ 48  3.2.2.2. Antidromic Firing Index......................................................................................... 49  3.2.2.3. Peripheral Nerve‐Evoked STT Responses.......................................................... 49  3.2.2.3.1. Sural Nerve‐Evoked STT Responses ............................................................ 51  3.2.2.3.2. Sciatic Nerve‐Evoked STT Responses .......................................................... 55 

 

v  

  3.2.3. EFFECTS OF BILATERAL MICROINJECTIONS OF VEHICLE CONTROL  SOLUTION/PENTOBARBITAL INTO THE RAT MPTA ON THE  ELECTROPHYSIOLOGICAL PARAMETERS OF STT NEURONS...................... 59  3.2.3.1. MICROINJECTIONS OF VEHICLE CONTROL SOLUTION ....................... 59  3.2.3.1.1. Spontaneous Firing Rate: Vehicle Control Microinjections .................... 59  3.2.3.1.2. Interspike Interval Data: Vehicle Control Microinjections...................... 64  3.2.3.1.3. Antidromic Firing Index: Vehicle Control Microinjections..................... 67  3.2.3.1.4. Sural Nerve‐Evoked STT Responses:                   Vehicle Control Microinjections ................................................................... 70  3.2.3.1.5. Sciatic Nerve‐Evoked STT Responses:                   Vehicle Control Microinjections ................................................................... 74  3.2.3.2. MICROINJECTIONS OF PENTOBARBITAL................................................... 82  3.2.3.2.1. Spontaneous Firing Rate: Pentobarbital Microinjections......................... 82  3.2.3.2.2. Interspike Interval Data: Pentobarbital Microinjections.......................... 87  3.2.3.2.3. Antidromic Firing Index: Pentobarbital Microinjections ......................... 90  3.2.3.2.4. Sural Nerve‐Evoked STT Responses:                   Pentobarbital Microinjections ....................................................................... 94  3.2.3.2.5. Sciatic Nerve‐Evoked STT Responses:                   Pentobarbital Microinjections ....................................................................... 98  3.3. RESULTS OF HISTOLOGY OF MICROINJECTION SITES ..................................... 106  CHAPTER 4: DISCUSSION ......................................................................................................... 110  4.1. Introductory Remarks......................................................................................................... 110  4.2. Technical Considerations: Animal Model, Study Design, Histology,          and Statistical Analysis ...................................................................................................... 112  4.3. STT Neurons: General Properties .................................................................................... 119   

vi  

  4.4. Inhibition of Spontaneous and Evoked Responses of STT Neurons by  Pentobarbital Microinjections into the MPTA ............................................................ 122  4.4.1. Spontaneous Firing Rate ................................................................................................ 123  4.4.2. Interspike Interval Parameters...................................................................................... 128  4.4.3. Antidromic Firing Index................................................................................................. 129  4.4.4. Peripheral Nerve‐Evoked STT Responses .................................................................. 132  4.5. Time Course of Effects of Pentobarbital on the Spike Activity of STT Neurons ... 136  4.6. Possible Neural Mechanism(s) of Pentobarbital‐Mediated Suppression of STT  Neurons through the MPTA............................................................................................ 137  4.7. MPTA: A Possible Pronociceptive Center in the Brain? .............................................. 147  4.8. Future Directions ................................................................................................................. 150  CHAPTER 5: SUMMARY AND CONCLUSIONS .................................................................. 155  REFERENCES.................................................................................................................................. 157  APPENDICES.................................................................................................................................. 179  Appendix A.................................................................................................................................. 179  Appendix B .................................................................................................................................. 180 

 

vii  

 

LIST OF TABLES   

Table 3.1 

Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control   solution into the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation   on interspike interval parameters of STT neurons ……………………….…....66 

 

Table 3.2 

Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control   solution into the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation   on the electrophysiological parameters of Group I STT neurons.……….…....79 

 

Table 3.3 

Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control   solution into the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation   on the electrophysiological parameters of Group III STT neurons…...…...…80 

 

Table 3.4 

Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control   solution into the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation   on electrophysiological parameters obtained by combining the results  obtained from Groups I and III STT neurons…………………………………...81 

 

Table 3.5 

Summary of effects of bilateral microinjections of pentobarbital   into the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation on interspike  interval parameters of STT neurons…...…………………………...……………89 

 

Table 3.6 

Summary of effects of bilateral microinjections of pentobarbital   into the MPTA of the isoflurane‐anesthetized rat preparation on   the electrophysiological parameters of Group II STT neurons………………103 

   

viii  

  Table 3.7 

Summary of effects of bilateral microinjections of pentobarbital   into the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation on the   electrophysiological parameters of Group III STT neurons …........................104 

 

Table 3.8 

Summary of combined results of effects of bilateral microinjections   of pentobarbital into the MPTA of the isoflurane‐anesthetized rat   preparation on electrophysiological parameters of Group II and   Group III STT neurons…………………..…………………………….…………105 

 

ix  

 

LIST OF FIGURES    Figure 2.1  

Schematic of the experimental setup for extracellular recording   of STT neurons and intracerebral microinjections of pentobarbital   and/or vehicle control solutions into the MPTA…...…………………………...36   

Figure 2.2 

Photograph of microinjection cannula system used for intracerebral  microinjections of pentobarbital/vehicle control solutions……………………37   

Figure 2.3 

Flowchart of the steps involved in electrophysiological parameter  recording and microinjections procedures……………………………………..38   

Figure 3.1 

Criteria used for antidromic identification of STT neuron……………………42 

 

Figure 3.2 

Schematic diagram of estimated thalamic stimulation and spinal  recording sites of STT neurons recorded in isoflurane‐anesthetized   rat preparation……………………………………………………………………..43   

Figure 3.3 

Correlation between axonal conduction velocity and spinal recording   depth of STT neurons….………………………………………………….……….46   

Figure 3.4 

Schematic explanation of STT neurons classified into three groups   based on the treatment(s) they received………………………………………...47   

Figure 3.5 

Correlation of baseline spontaneous firing rate with spinal and axonal  conduction velocity of STT neurons……………………………………………..50  

Figure 3.6 

Example of sural nerve‐evoked STT responses……………...…………………53   

x  

  Figure 3.7 

Absence of habituation of sural nerve‐evoked STT responses......……………54    

Figure 3.8 

Example of sciatic nerve‐evoked STT responses……………….………………57  

 

Figure 3.9 

Absence of habituation of sciatic nerve‐evoked STT responses.……………...58    

Figure 3.10 

Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into the   MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation on the spontaneous   rate of firing STT neurons.....…………..………………………...….……………61    

Figure 3.11 

Spontaneous firing rate of each STT neuron before and after bilateral  microinjections of vehicle control solution into the MPTA of isoflurane‐ anesthetized rat preparation..…………………………………….………….…...62 

 

Figure 3.12 

Example of a continuous ratemeter histogram trace depicting the  spontaneous firing rate of a STT neuron before and following bilateral  microinjections of vehicle control solution into the MPTA………………........63 

 

Figure 3.13 

Example of interspike interval histogram (ISIH) distributions of   spike activity of a lumbar STT neuron recorded before and after   bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA   of isoflurane‐anesthetized rat preparation...….…..…...….…………………….65   

Figure 3.14 

Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into   the MPTA on the antidromic firing index of STT neurons in the   isoflurane‐anesthetized rat preparation...…………….………...……………….68 

   

xi  

  Figure 3.15 

Antidromic firing index of each STT neuron before and after   bilateral microinjections of vehicle control solution into the   MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation……………………………...69 

 

Figure 3.16 

Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into   the MPTA of the isoflurane‐anesthetized rat preparation on sural   nerve‐evoked responses of STT neurons………………………...……...………71 

 

Figure 3.17 

Example of presynaptic afferent volley recorded in the spinal cord   evoked by stimulation of sural nerve......……………...………………………...72   

Figure 3.18 

Effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into   the MPTA of the isoflurane‐anesthetized rat preparation on sural   nerve‐evoked afferent volley recorded in the lumbar spinal cord of   isoflurane‐anesthetized rat preparation………..………………………………..73   

Figure 3.19 

Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into the   MPTA of the isoflurane‐anesthetized rat preparation on sciatic nerve‐  evoked responses of STT neurons.……………………………………………….76  

 

Figure 3.20 

Example of presynaptic afferent volley recorded in the spinal cord   evoked by stimulation of sciatic nerve..………………...……………………….77 

 

Figure 3.21 

Effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into   the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation on sciatic nerve‐  evoked afferent volley recorded in the lumbar spinal cord of the   isoflurane‐anesthetized rat preparation………..………………………………..78   

xii  

  Figure 3.22 

Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA   of the isoflurane‐anesthetized rat preparation on the spontaneous   firing rate of STT neurons………………………...………………...…………….84   

Figure 3.23 

Spontaneous firing rate of each STT neuron before and after bilateral  microinjections of pentobarbital into the MPTA of isoflurane‐  anesthetized rat preparation…………………..…………………….…………...85   

Figure 3.24 

Example of a continuous ratemeter histogram trace depicting the  spontaneous firing rate of a STT neuron before and following the   bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of the   isoflurane‐anesthetized rat……….…..…………….……………………………..86   

Figure 3.25 

Example of interspike interval histogram (ISIH) distributions of   spike activity of a lumbar STT neuron recorded before and after   bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of isoflurane‐  anesthetized rat preparation……………...…………….……………...................88 

 

Figure 3.26 

Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA   of the isoflurane‐anesthetized rat preparation on the antidromic   firing index of STT neurons……………………...……………………………….92 

 

Figure 3.27 

Antidromic firing index of each STT neuron before and after   bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of   isoflurane‐anesthetized rat preparation…………………………………………93 

   

 

xiii  

  Figure 3.28 

Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA   of isoflurane‐anesthetized rat preparation on sural nerve‐evoked   responses of STT neurons……………………………….……………….………..96   

Figure 3.29 

Effects of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA   on sural nerve‐evoked afferent volley recorded in the lumbar spinal   cord of isoflurane‐anesthetized rat preparation………..…………..…………..97   

Figure 3.30 

Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA   of isoflurane‐anesthetized rat preparation on sciatic nerve‐evoked   responses of STT neurons………………..………….………………………...…101   

Figure 3.31 

Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA   of isoflurane‐anesthetized rat preparation on sciatic nerve‐evoked   afferent volley recorded in the lumbar spinal cord of the isoflurane‐  anesthetized rat preparation…...………………..………………………………102 

 

Figure 3.32 

Representative examples of anatomical location of MPTA in the rat  

 

brainstem………………………………………………………………………….107 

 

 

Figure 3.33 

Summary of anatomical locations of dye microinjections within the   MPTA of rat brain stem…………………...…………….……………………….109 

 

Figure 4.1 

Schematic of the hypothetical neural circuitry involved in suppression   of STT neuron by pentobarbital microinjections into the rat MPTA…...…...145 

 

 

xiv  

 

LIST OF SYMBOLS AND ABBREVIATIONS    ANOVA  

analysis of variance 

AMPA  

alpha‐amino‐3‐hydroxy‐5‐methyl‐4‐isoxazolepropionic acid 

AP 

 

anterior‐posterior distance from the bregma 

°C 

 

degree Celsius 

CD 

 

coefficient of dispersion 

cm 

 

centimeter(s) 

CNS   

central nervous system 

CO2 

 

carbon dioxide 

CSF 

 

cerebrospinal fluid 

CV 

 

coefficient of variation 

DRt 

 

dorsal reticular nucleus 

DV 

 

ventral distance from the dorsal surface of brain 

EEG 

 

electroencephalogram 

FI 

 

antidromic firing index  

g 

 

gram(s) 

GABA  

gamma aminobutyric acid 

h 

 

hour(s) 

Hz 

 

hertz 

 

xv  

  ID 

 

inner diameter 

i.m. 

 

intramuscular 

i.v. 

 

intravenous 

ISIH   

interspike interval histogram 

kg 

 

kilogram(s) 

kHz 

 

kilohertz 

L 

 

liter(s) 

L1 

 

first lumbar vertebra/spinal segment 

L2 

 

second lumbar vertebra/spinal segment 

LC 

 

locus ceruleus 

LTD 

 

long‐term depression 

LTP 

 

long‐term potentiation 

m 

 

meter(s) 

M 

 

mole 

ML 

 

lateral distance from the midline 

MΩ 

 

megaohm(s) 

μA 

 

microampere(s) 

μg 

 

microgram(s) 

μL 

 

microliter(s) 

μm 

 

micrometer(s) 

 

xvi  

  mA 

 

milliampere(s)  

mL 

 

milliliter(s) 

mm 

 

millimeter(s) 

ms 

 

millisecond(s) 

min 

 

minute(s) 

MPA   

medial preoptic area 

MPTA  

mesopontine tegmental anesthesia area 

NaCl   

sodium chloride 

NE 

 

norepinephrine 

nM 

 

nanomol 

NMDA 

N‐methyl‐D‐aspartic acid 

NRGC 

nucleus reticularis gigantocellularis 

 

NRM   

nucleus raphe magnus 

NREM  

non‐rapid eye movement 

OD 

outer diameter 

 

PAD   

primary afferent depolarization 

PAG   

periaqueductal grey 

PAH   

primary afferent hyperpolarization 

PB 

 

pentobarbital 

PBS 

 

phosphate buffered saline 

 

xvii  

  PE 

 

polyethylene 

PTg 

 

pedunculopontine tegmental nucleus 

PSTH   

poststimulus time histogram 

REM   

rapid eye movement 

RVM   

rostral ventromedial medulla 

s 

second(s) 

 

5‐HT   

serotonin (5‐hydroxytryptamine) 

Sc‐ER   

sciatic nerve stimulation‐evoked response(s) 

SEM   

standard error of mean 

SFR 

 

spontaneous firing rate 

STT 

 

spinothalamic tract  

SS 

 

stainless steel 

Su‐ER   

sural nerve stimulation‐evoked response(s) 

T 

 

threshold intensity 

T12 

 

twelfth thoracic vertebra/spinal segment 

T13 

 

thirteenth thoracic vertebra/spinal segment 

TC 

 

thalamocortical 

TMN   

tuberomammillary nucleus 

Vh 

 

vehicle control solution 

VPL 

 

ventral posterior lateral nucleus of thalamus

 

xviii  

 

ACKNOWLEDGEMENTS  As I come to this milestone in the pursuit of knowledge, I cannot help but reflect back and  acknowledge all those who have contributed towards completion of this work in one or the  other way.  First of all, I offer my deepest gratitude to Almighty GOD for showering HIS infinite  bounties,  graces  and  mercies  on  me.  Without  HIS  wishes  and  blessings,  this  work  could  have remained a dream only.   

I  would  like  to  dedicate  this  work  to  my  parents  for  their  unconditional  love, 

encouragement and to my wife Archana for her immense love and support, who stood with  me in every good and bad moment. I would also like to thank my parents‐in‐law for their  constant motivation and support.   

I  express  my  deepest  gratitude  for  my  mentor  Dr.  Peter  Soja  for  his  guidance, 

unstinting  support,  constant  encouragement,  constructive  criticism  and  valuable  suggestions throughout my work. Thank you Peter for introducing me to the exciting world  of  neuroscience.  It  has  been  an  enriching  experience  and  privilege  working  in  your  laboratory.    

This  work  was  supported  by  the  grants  from  U.S.  National  Institutes  of  Health 

(NS041921) and Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to Dr. Peter Soja.    

My sincere thanks to Dr. Shelly A. McErlane, who helped me throughout my study. 

Thank  you  Shelly  for  teaching  me  aseptic  neurosurgical  techniques  and  sharing  your  vast  knowledge of animal care. It has been a delight working with you.   

I would like to thank my supervisory committee members Drs. Marc Levine (Chair), 

Sastry  Bhagavatula,  Anthony  Pearson  and  Nicholas  Swindale  for  providing  their  critical  review of this thesis and the benefit of their experience and expertise. 

 

xix  

   

Special  thanks  are  extended  to  Dr.  Niwat  Taepavarapruk  for  helping  me  with  the 

schematic of the experimental setup.   

I am grateful to Dr. Ernest Puil for kindly providing me with pentobarbital used in 

this thesis.   

I would also like to convey my deepest gratitude to Dr. Ujendra Kumar for allowing 

me to use his laboratory facility for the rat brain histology. Special thanks are also extended  to  Padmesh  Rajput  for  helping  me  with  the  histological  examinations  and  imaging  of  rat  brain samples.   

Special  thanks  are  passed  on  to  Dr.  Elissa  Strome  for  sharing  some  useful  tips  for 

microinjection  techniques  as  well  as  for  providing  stainless  steel  cannulae  for  the  drug  microinjections.    

Thanks  are  also  extended  to  my  colleague,  Xu  (Ervin)  Zhu  for  his  help  during  the 

initial part of my experiments.   

I  would  like  to  thank  the  Faculty  of  Pharmaceutical  Sciences  at  the  University  of 

British Columbia for allowing me to use its facilities as well as providing me with Teaching  and Research Assistantships.   

Last  but  not  the  least  I  would  like  to  thank  all  my  well‐wishers,  who  directly  or 

indirectly contributed to this thesis work.      DHANANJAY NAMJOSHI   

 

 

 

 

xx  

 

DEDICATIONS     

Dedicated to

My Parents

&

My Wife and Best Friend

Archana

 

xxi  

General Introduction 

CHAPTER 1   GENERAL INTRODUCTION 

General  anesthesia  is  a  chemically  induced,  reversible,  loss  of  consciousness  that  is  accompanied  by  analgesia,  atonia,  and  abolition  of  autonomic  responses.  Since  the  first  successful  demonstration  of  ether  anesthesia  by  Morton  in  1846  (see,  Whalen  et  al.,  2005),  general  anesthetics  have  been  widely  used  clinically.  Despite  over  150  years  of  clinical  practice  with  general  anesthetics,  exactly  how  structurally  and  pharmacologically  distinct  substances  act  to  cause  general  anesthesia  is  not  yet  completely  understood.  Our  current  knowledge about the mechanism(s) by which general anesthetics act has gradually evolved  through in vitro studies that were principally focused on cellular and subcellular targets. The  prevailing  view  is  that  general  anesthetics  bind  to  specific  neurotransmitter  receptors  and  inhibit  neuronal  firing  by  dampening  excitatory  synaptic  transmission  and/or  potentiating  synaptic  inhibition.  The  state  of  general  anesthesia  represents  a  consortium  of  different  behavioral  components  including  unconsciousness,  analgesia,  atonia,  and  attenuation  of  autonomic  responses  (Evers  et  al.,  2006).  However,  exactly  which  neural  circuits  are  involved in the different components of general anesthesia is still unclear. To correlate the  observed clinical effects of general anesthetics to their molecular mechanism(s) of actions, it  is  necessary  to  dissect  out  specific  neural  structures/networks  involved  that  mediate  the  different components of general anesthesia, for example analgesia.  

 

1 

General Introduction 

1.1.  Mechanism(s)  of  Actions  of  General  Anesthetics:  From  Lipid  to  Protein  Theory 

Since substances with a wide array of chemical structures and/or classes can induce general  anesthesia,  several  hypotheses  were  proposed  to  link  their  actions  to  a  single  mechanism.  Following the first public demonstration of general anesthesia, three theories have emerged  to  explain  the  mechanisms  of  general  anesthetic  actions.  The  very  first  theory  of  general  anesthesia  was  proposed  by  the  French  physiologist,  Claude  Bernard  in  1875.  Bernard  proposed that general anesthetics act by “reversible coagulation” of chemical constituents of  nerves  and  muscles,  in  particular,  their  proteins  (Leake,  1971).  Bernard’s  theory  was  subsequently  refuted  for  the  reasons  that  coagulation  of  proteins  required  a  given  general  anesthetic  in  a  concentration  that  was  much  higher  than  that  required  for  general  anesthesia.  About  thirty  years  later,  Meyer  (1899)  and  Overton  (1901)  independently  proposed  the  lipid  theory  of  general  anesthesia.  The  Meyer‐Overton  lipid  hypothesis  was  based  on  the  observed  correlation  between  the  lipid  solubility  and  potency  of  general  anesthetics.  Accordingly,  the  lipid  hypothesis  proposed  that  general  anesthetics  act  by  perturbation  of  the  lipid  membrane.  The  lipid  theory  enjoyed  a  wide,  unchallenged  acceptance for nearly eight decades.  

 

The  lipid  theory  paradigm  was  severely  challenged  by  the  pioneering  work  of 

Franks  and  Lieb  (1984),  who,  in  their  ‘protein  theory’,  proposed  that  anesthetics  could  directly  bind  and  modulate  membrane  proteins.  Since  then,  the  research  emphasis  has  shifted from the lipid theory to membrane receptors. Studies over the last two decades have 

2 

General Introduction  revealed  several  voltage‐gated  (Na+,  K+  and  Ca2+)  and  ligand‐gated  (GABA,  glycine,  acetylcholine,  NMDA  and  AMPA)  ion  channels  as  targets  of  general  anesthetics  (for  reviews,  see  Franks  and  Lieb,  1998;  Belelli  et  al.,  1999;  Krasowski  and  Harrison,  1999;  Thompson  and  Wafford,  2001;  Campagna  et  al.,  2003;  Mashour  et  al.,  2005).  The  current  consensus is that general anesthetics modulate a variety of neurotransmitter channels in the  CNS in a distributed manner to cause general anesthesia. 

1.2. Central Sites of General Anesthetic Actions 

Although  much  is  now  known  about  the  molecular  and  cellular  mechanisms  of  general  anesthetics, our understanding of the regions of the CNS affected by them remains elusive.  An  understanding  of  the  neural  networks  affected  by  general  anesthetics  is  required  for  linking their molecular actions to their observed clinical effects. Along these lines, the effects  of  various  anesthetics  have  been  studied  primarily  in  the  brain  including  various  cortical  (Alkire  et  al.,  1995;  Alkire,  1998;  Fiset  et  al.,  1999;  Hayton  et  al.,  1999)  and  sub‐cortical  (Guilbaud et al., 1981; Antognini and Carstens, 1999a; Detsch et al., 1999; Ries and Puil, 1999;  Alkire et al.,  2000) sites. Parallel  experiments in rats  (Rampil  et  al.,  1993; King  and  Rampil,  1994; Rampil, 1994; Rampil and King, 1996), cats (Namiki et al., 1980), goats (Antognini and  Schwartz,  1993;  Antognini  and  Kien,  1994),  and  humans  (Zhou  et  al.,  1997)  indicate  that  besides  the  brain,  the  spinal  cord  is  another  important  site,  for  anesthetic  action.  The  principal putative sites in the spinal cord for the actions of general anesthetics are the dorsal  horn  and  motoneuron  pools.  It  is  now  widely  accepted  that  the  unconsciousness  and  amnesia caused by the general anesthetics are attributed to their supraspinal actions, while 

3 

General Introduction  analgesia and atonia are due to the actions of general anesthetics in the spinal cord (Collins  et al., 1995; Antognini, 1997; Antognini and Carstens, 1998, 1999a; Antognini et al., 1999). In  addition, many non‐neural sites, including glial cells, cells  of the skeleton, cardiomyocytes  and  cells  comprising  the  immune  systems  have  also  been  reported  as  targets  of  general  anesthetics (Urban, 2002). 

1.3.  Mesopontine  Tegmental  Anesthesia  Area:  Potential  Central  Site  for  the  Induction of General Anesthesia 

The  studies  in  the  field  of  general  anesthesia  so  far  have  assessed  global  but  not  specific  neural circuits in the CNS where anesthetics might act. Recent intracerebral microinjection  studies  in  rats  have  provided  evidence  of  discrete  loci  in  the  brain  that  may  likely  be  involved in barbiturate‐induced anesthesia. (Devor and Zalkind, 2001) recently reported on  the  discovery  in  conscious  rats  of  a  discreet  locus  in  the  brainstem  pontomesencephalic  tegmentum,  which  might  be  involved  in  pentobarbital  (PB)‐induced  general  anesthesia.  In  this  exploratory  study,  microliter  quantities  of  PB  were  injected  into  various  brain  stem  areas of conscious rats while the animals’  anesthesia scores  (based  on standard  behavioral  assessment)  and  electroencephalogram  (EEG)  were  recorded.  The  authors  reported  that  bilateral  microinjections  of  PB  into  a  focal  zone  in  the  mesopontine  tegmentum  induced  a  reversible  “anesthesia‐like”  behavioral  state  characterized  by  flaccid  muscle  atonia,  analgesia,  loss  of  consciousness  and  righting  reflexes  along  with  a  shift  in  the  EEG  waveform pattern from low‐voltage, desynchronized, “fast‐wave” pattern to a high‐voltage,  synchronized, “slow‐wave” pattern. In the same study, microinjections of phenobarbital, the 

4 

General Introduction  selective  GABAA  receptor  agonist,  muscimol  (Johnston,  1996)  and  alphathesin,  a  steroid  anesthetic, mimicked the effects of PB. Since the cytoarchitectonic boundaries and the target  neuron population of this brain stem area were not clearly defined, the authors coined the  term mesopontine tegmental anesthesia area (MPTA) to describe this focal site. The authors  concluded  that  the  MPTA  contains  a  barbiturate‐sensitive  “switch”  that  may  modulate  ascending  and  descending  pathways  producing  the  state  of  anesthesia.  The  authors  have  further reported that, the anesthetic actions of PB within the MPTA were highly site‐specific.  That  is,  microinjections  of  PB  in  the  areas  surrounding  MPTA  either  failed  to  induce  anesthesia  or  induced  only  mild  sedation.  Notably,  these  sites  surrounding  the  MPTA  included the periaqueductal grey (PAG), which is involved in morphine‐induced analgesia  (Fields  et  al.,  2006)  and  the  pedunculopontine  tegmental  nucleus  (PTg),  which  plays  an  important role in regulation of the sleep‐wake cycle (Rye et al., 1987; Steriade and McCarley,  2005).  

Surprisingly,  in  the  Devor  and  Zalkind  (2001)  study,  microinjections  of  the  local  anesthetic lidocaine into MPTA failed to reproduce the anesthetic effects of PB. The reason  for  this  discrepancy  is  not  presently  known.  One  possible  reason  may  be  that  the  concentration  of  the  intracerebrally  microinjected  lidocaine  (2%,  0.5  μL  volume)  used  by  Devor  and  Zalkind  (2001).  In  some  earlier  intracerebral  microinjection  studies  in  rats  (Aimone  and  Gebhart,  1986;  Ren  et  al.,  1990)  a  4%  lidocaine  (0.5  μL  volume)  was  used  to  block  the  activity  of  local  circuit  neurons.  Thus  it  may  be  possible  that  the  lower 

5 

General Introduction  concentration  used  by  Devor  and  Zalkind  (2001)  was  insufficient  to  block  the  MPTA  neurons to induce general anesthesia.  

Recently,  the  Devor  group  has  reported  that  the  anesthetic  effects  of  PB  microinjections  were  antagonized  by  pre‐microinjections  of  selective  GABAA  receptor  antagonist, bicuculline (Seutin and Johnson, 1999) into the MPTA (Sukhotinsky et al., 2007).  This  suggests  that  the  anesthesia  induced  by  PB  microinjections  into  the  MPTA  involves  GABAA  receptor‐mediated  mechanisms.  In  further  neuroanatomical  tracing  studies,  the  Devor group has demonstrated that the neurons in the MPTA express GABAA receptors and  send axonal projections to various anatomical sites in the higher and lower brain centers as  well  as  spinal  cord  (Sukhotinsky  et  al.,  2003).  The  targets  of  MPTA  projections  include  components of the endogenous motor control systems including the pontine and medullary  reticular  formation,  structures  in  the  rostral  ventromedial  medulla  (RVM),  and  substantia  nigra (Sukhotinsky et al., 2005). MPTA neurons are also reciprocally connected with several  supraspinal  structures  involved  in  the  control  of  pain  transmission,  including  the  periaqueductal  grey  (PAG),  relay  nuclei  in  the  RVM,  in  particular,  the  nucleus  reticularis  gigantocellularis (NRGc) (Sukhotinsky et al., 2006). Recently, Sukhotinsky et al. (2007) have  reported  axonal  projections  of  the  MPTA  neurons  to  higher  brain  centers,  which  are  involved in the control of consciousness. These structures include the intralaminar nuclei of  the  thalamus,  the  hypothalamus,  the  cholinergic  PTg,  the  laterodorsal  tegmental  nucleus,  and forebrain (Sukhotinsky et al., 2007). Interestingly, there are almost no MPTA projections  to the thalamic sensory relay nuclei (Sukhotinsky et al., 2007). Finally, MPTA neurons send 

6 

General Introduction  distinct axonal projections to the dorsal and ventral horns of the spinal cord (Sukhotinsky et  al.,  2006;  Reiner  et  al.,  2007;  Sukhotinsky  et  al.,  2007).  Thus,  microinjection  of  barbiturate  anesthetics  into  the  MPTA  may  inhibit  local  circuit  GABAergic  neurons,  which  in  turn,  modulate the activities of various target regions of the MPTA in the brain and spinal cord  inducing the behavioral state of general anesthesia.  

In  a  recent  study,  Voss  et  al.  (2005)  have  corroborated  the  findings  of  Devor  and  Zalkind  (2001)  by  reporting  that  microinjections  of  the  short‐acting  barbiturate  anesthetic,  thiopental  into  the  MPTA  of  conscious  rats  induced  general  anesthesia‐like  state.  In  the  same study, microinjections of non‐barbiturate anesthetic propofol into the MPTA failed to  induce  general  anesthesia.  This  finding  by  Voss  et  al.  (2005)  is  interesting,  given  that  propofol,  like  barbiturate  anesthetics,  acts  by  enhancing  the  inhibitory  GABAergic  neurotransmission (Trapani et al., 2000; Irifune et al., 2003). It may be possible, that the dose  of  propofol  microinjected  into  the  MPTA  may  have  been  insufficient  to  induce  general  anesthesia.  Secondly,  propofol  may  be  acting  by  engaging  neurons  other  than  the  MPTA  neurons.  Alternately,  this  may  also  be  attributable  to  the  mechanisms  by  which  propofol  and  barbiturates  modulate  the  kinetic  properties  of  GABAA  receptor‐Clˉ  channel.  While  at  anesthetic  concentrations,  both  the  barbiturates  and  propofol  increase  the  Clˉ  flux  through  the GABAA receptor channel, barbiturates increase the mean channel open time of GABAA  receptor  without  altering  the  channel  conductance  (Macdonald  and  Olsen,  1994).  On  the  other  hand,  therapeutic  concentrations  of  propofol  increase  the  probability  of  GABAA  receptor Clˉ channel being in the open state (Hara et al., 1993; Orser et al., 1994; Trapani et al., 

7 

General Introduction  2000).    This  raises  a  question  whether  MPTA‐mediated  induction  of  general  anesthesia  is  dependent on the way in which the kinetic properties of GABAA receptors are modulated.  

From the studies of the Devor group, it appears that MPTA has an important role in  the induction of general anesthesia. However, is MPTA the sole site for induction of general  anesthesia? One potential way to answer this question is by microinjecting bicuculline, into  the  MPTA  of  the  same  animal  model  as  used  by  Devor  and  Zalkind  (2001),  followed  by  intravenous  (i.v.)  administration  of  anesthetic  dose  of  PB.  If  i.v.  administration  of  PB  following  bicuculline  microinjections  into  the  MPTA  fails  to  induce  a  general  anesthetic  state,  it  may  be  logical  to  suggest  that  the  MPTA  plays  a  significant  role  in  engaging  the  state of barbiturate‐induced general anesthesia. There are, however parallel studies, which  indicate that brain nuclei distinct from the MPTA, may also play important role(s) in general  anesthetic  unconsciousness.  For  example,  Nelson  et  al.(2002)  recently  reported  dose‐ dependent  sedation  and  a  loss  of  the  righting  reflex,  a  hallmark  of  anesthesia  in  animals,  after  microinjection  of  muscimol,  a  GABAA  agonist  into  the  tuberomammillary  nucleus  (TMN) of conscious rats. In the same study, microinjections of PB and propofol in the TMN  produced only sedation. These responses were antagonized by the putative GABAA receptor  antagonist,  gabazine.  The  TMN  is  a  small  area  located  in  the  hypothalamus  which  sends  major histaminergic input to the cortex and is known to play a critical role in the sleep‐wake  cycle (Lin et al., 1990; Wada et al., 1991). Interestingly, the MPTA has very little connectivity  with the TMN (Sukhotinsky et al., 2007). Thus these two brain areas, i.e., MPTA and TMN,  may  be  acting  independently  in  the  control  of  consciousness.  In  a  similar  type  of  study, 

8 

General Introduction  microinjections  of  PB  into  the  medial  preoptic  area  (MPA)  of  rat  brain  induced  sleep  with  reduced sleep onset latency and increased non‐rapid eye movement (NREM) sleep as well  as  total  sleep  time  (Mendelson,  1996).  It  is  not  known  presently  if  any  neural  connectivity  exists between MPA and MPTA. 

1.4. The Spinothalamic Tract 

The  spinothalamic  tract  (STT)  is  the  most  important  and  extensively  studied  ascending  sensory pathway in the anterolateral quadrant of the spinal cord projecting to the thalamus  (Hodge  and  Apkarian,  1990;  Willis  and  Westlund,  1997).  STT  neurons  receive  and  relay  nociceptive, tactile, and thermal information from the periphery to the higher centers in the  brain (Willis, 1985; Willis and Westlund, 1997; Willis and Coggeshall, 2004). In addition, the  STT  has  also  been  implicated  in  postural  changes  and  locomotion  (Menetrey  et  al.,  1984).  The  distribution  of  the  cell  bodies  of  STT  neurons  in  the  spinal  cord  is  species‐specific.  Studies  in  the  rat  have  shown  that  majority  of  the  STT  neurons  are  located  in  the  nucleus  proprious,  deep  dorsal  horn,  ventromedial  zone  and  dorsomedial  ventral  horn  (Giesler  et  al., 1979; Giesler et al., 1981a; Yezierski and Bowker, 1981). The axons of the majority of rat  STT neurons decussate initially towards the ventral funiculus and then migrate to the lateral  funiculus  while  ascending  to  the  contralateral  thalamus.  In  rodent  brain,  the  major  termination site for STT axons is the ventral posterior lateral (VPL) nucleus of the thalamus  (Willis, 1985; Hodge and Apkarian, 1990). STT axons also send collaterals to the medullary  reticular  formation  (Kevetter  and  Willis,  1982),  parabracheal  area  (Hylden  et  al.,  1989)  and  periaqueductal  gray  (Kevetter  and  Willis,  1983;  Liu,  1986;  Harmann  et  al.,  1988).  STT 

9 

General Introduction  neurons receive a variety of both somatic and visceral afferent inputs. This has been shown  by  electrically  stimulating  visceral,  cutaneous,  and  motor  nerves  (Foreman  et  al.,  1975;  Chung et al., 1979; Ammons, 1989). 

1.5. Study Rationale 

The  intracerebral  microinjection  studies  reviewed  here  suggest  that  certain  neural  foci  within the brain may play important roles in the generation of unconsciousness due to sleep  or general anesthesia. The discoveries of discrete intracerebral foci, when modulated by an  anesthetic  drug  to  evoke  a  behavioral  anesthetic  state,  have  challenged  the  contemporary  view  that  general  anesthetics  act  in  a  non‐site‐specific  manner  by  ubiquitous  inhibition  of  CNS neurons. The Devor and Zalkind (2001) study, however, was based on the behavioral  assessment  of  the  animals.  The  neurophysiological  basis  of  PB  microinjection‐induced  anesthesia is not known. The purpose of the study presented in this thesis was to partially  address this issue.  

The  two  very  important  components  that  are  considered  as  part  of  the  state  of  general  anesthesia  are  analgesia  and  atonia.  In  the  microinjection  study  of  Devor  and  Zalkind (2001), the behavioral assessment of the animal showed that presence of PB in the  MPTA  caused  both  analgesia  and  atonia.  However,  it  may  very  well  be  that  the  analgesia  reported in this study was a consequence of the animal’s failure to elicit nociceptive motor  responses to the noxious stimuli due to atonia. Accordingly, there is lack of sound evidence  that  microinjections  of  PB  into  the  MPTA  caused  analgesia.  One  way  to  address  this 

10 

General Introduction  question is by assessing the physiological properties of sensory tract neurons in the spinal  cord after PB microinjections into the MPTA.  

The  afferent  fibers  carrying  sensory  (and  nociceptive)  information  from  the  peripheral  tissues  make  synaptic  connectivities  with  several  second‐order  ascending  pathways  in  the  spinal  cord.  These  ascending  pathways,  in  turn,  transmit  the  sensory  signals  to  the  higher  brain  centers.  As  mentioned  previously,  suppression  of  noxious  stimuli‐induced  responses  by  most  of  the  general  anesthetics  (inhalational,  barbiturates,  propofol  and  nitrous  oxide)  is  thought  to  be  due  to  their  direct  actions  on  the  spinal  cord  (Collins  et  al.,  1995;  Antognini  and  Carstens,  1998).  Thus,  it  may  be  possible  that  general  anesthetic‐induced  analgesia  is  due  to  the  suppression  of  the  spinal  ascending  pathways  (e.g.,  the  STT),  which  transmit  nociceptive  input  from  the  periphery  to  the  brain.  Surprisingly,  there  are  few,  if  any,  studies  assessing  the anesthetic‐induced  changes  in  the  physiological characteristics of ascending spinal sensory tract neurons.  

Soja  et  al.  (2002)  have  reported  that  intravenous  injection  of  thiopental  reversibly  suppressed  the  spike  activities  of  electrophysiologically  identified  (proprioceptive)  dorsal  spinocerebellar  tract  (DSCT)  and  (nociceptive)  spinoreticular  tract  (SRT)  neurons  in  the  chronic  cat preparation. Their study was  unique  because  it examined  the  activity of DSCT  and SRT neurons in the awake, unanesthetized animal, free from recent surgery. The effects  of the anesthetic, thiopental were examined on DSCT and SRT neurons under near‐natural  conditions.  The  results  obtained  by  Soja  et  al.  (2002)  indicate  that  barbiturate  anesthetics  suppress ascending non‐nociceptive and nociceptive transmission through the spinal cord. 

11 

General Introduction  However,  since,  the  anesthetic  was  delivered  through  the  i.v.  route  it  may  have  acted  in  other parts of the CNS besides the spinal sensory neurons, perhaps even the MPTA (Devor  and Zalkind, 2001).  

The  PB  microinjection  studies  reported  by  Devor  and  Zalkind  (2001)  and  the  electrophysiological studies reported by Soja et al. (2002), thus, present a unique provenance  for  studying  the  effects  of  intracerebrally  administered  barbiturate  anesthetics  on  the  activity of spinal nociceptive neurons. Accordingly, in the present thesis, the excitability of  identified  spinothalamic  tract  (STT)  neurons  was  assessed  before,  during  and  after  microinjections of PB into the MPTA of the rat brain.  

1.6. Research Hypothesis 

The research hypothesis for the present study was:  “Bilateral  microinjections  of  pentobarbital  into  the  mesopontine  tegmental  anesthesia  area  (MPTA)  of  the  rat  brain,  suppresses  sensory  inflow  through  the  spinothalamic tract.” 

1.7. Research Objectives   

The  overall  objective  of  the  study  reported  in  this  thesis  was  to  assess  the  electrophysiological  parameters  of  identified  spinothalamic  tract  (STT)  neurons  of  the  rat,  namely, the spontaneous discharge, antidromic excitability  and afferent nerve stimulation‐ evoked  responses  after  bilateral  microinjections  of  PB  into  the  MPTA.  For  the  purpose  of 

12 

General Introduction  this study, the highest effective concentration of 200 μg/μL (800 nM) with the largest volume  of 1 μL/side of PB, which induced a behavioral state of general anesthesia in conscious rats  (Devor and Zalkind, 2001) was used. In the control studies, PB‐free vehicle control solution  (Vh, 1 μL/side) was microinjected into the MPTA. Since the cytoarchitectonic boundaries of  MPTA are not yet clearly defined, the stereotaxic coordinates referring to the MPTA zone in  this  study  were  derived  from  the  information  of  the  surrounding  structures  reported  by  Devor  and  Zalkind  (2001)  and  the  stereotaxic  atlas  of  the  rat  brain  (Paxinos  and  Watson,  2007), which together, corroborated with those reported in recent papers (Voss et al., 2005;  Sukhotinsky  et  al.,  2006).  A  brief  detail  of  each  electrophysiological  parameter  is  given  below. 

Electrophysiological Parameter 1: Assessment of Spontaneous Firing Rate 

The  spontaneous  spike  activity  of  a  STT  neuron  is  defined  as  the  cell’s  background  spike  activity  in  the  absence  of  any  stimulus.  Thus,  it  would  be  useful  to  determine  if  bilateral  microinjections  of  PB  into  the  MPTA  modulate  the  ongoing  afferent  input  and  rhythmic  properties of individual STT neurons. In this experimental paradigm, once the STT cell was  antidromically identified and confirmed, its spontaneous spike activity was recorded before  and  at  specified  time  intervals  after  microinjections  of  PB/Vh  into  the  MPTA.  Samples  of  recorded  spike  activity  were  analyzed  to  determined  mean  spike  rate,  interspike  interval,  coefficient of variation, and coefficient of dispersion. These two latter parameters are useful  for detecting indirectly whether changes in spontaneous firing rate due to drug actions are 

13 

General Introduction  also accompanied by changes in spike patterns (Cocatre‐Zilgien and Delcomyn, 1992; Soja et  al., 1996). 

Electrophysiological Parameter 2: Assessment of Antidromic Firing Index. 

The firing index (FI) is the probability of evoking action potentials in the neuron in response  to a consecutive number of stimuli applied to it (Lloyd and McIntyre, 1955). The FI method  has long being used for assessing changes in the postsynaptic excitability of motor neurons  (Hunt, 1955; Lloyd and McIntyre, 1955; Wilson and Burgess, 1962), group Ia and Ib afferents  (Wall,  1958;  Willis  et  al.,  1976),  tooth  pulp  afferents  (Lisney,  1979;  Cairns  et  al.,  1996),  and  some descending fiber systems (Rudomin and Jankowska, 1981). To assess changes in the FI,  the  identified  STT  neurons  were  “backfired”  with  100  consecutive  stimuli  applied  to  the  VPL  nucleus  at  threshold  stimulus  intensity.  The  numbers  of  antidromic  spikes  obtained  from  75  consecutive  stimuli  (excluding  the  collision  between  the  antidromic  and  orthodromic  spikes)  were  calculated  before  and  after  microinjections  of  PB/  Vh  into  the  MPTA.  A  decrease  in  the  FI  after  the  microinjections  compared  to  the  baseline  FI  would  indicate reduced excitability of the STT cell due to putative somatic hyperpolarization (Wall,  1958, 1962; Lipski, 1981).  

Electrophysiological  Parameter  3:  Assessment  of  Peripheral  Nerve  Stimulation‐Evoked  Responses  

STT  neurons  receive  tactile  and  afferent  nociceptive  input  from  the  skin  and  viscera.  Therefore,  in  this  study,  the  responsiveness  of  the  STT  neurons  to  the  afferent  peripheral 

14 

General Introduction  nerve  stimulation  was  assessed  following  the  microinjections.  In  the  present  experiments,  the sciatic (Sc) and sural (Su) nerves were stimulated to evoke synaptic responses recorded  in  STT  neurons.  The  Sc  nerve  is  the  largest  nerve  originating  from  the  lumbosacral  spinal  segments and innervates the lower extremities. It is a mixed nerve containing both sensory  and motor nerve fibers. The Su nerve is a sensory cutaneous nerve innervating the foot. It  joins  to  the  peroneal  nerve,  which  is  a  branch  of  the  sciatic  nerve.  The  mean  response  magnitude  and  latency  of  the  STT  neurons,  evoked  by  the  stimulation  of  both  of  these  nerves  were  studied  before  and  after  microinjection  of  PB  into  the  MPTA.  In  addition,  to  determine  if  microinjections  of  PB/Vh  changed  the  presynaptic  input,  the  peak‐trough  amplitude and latency of orthodromic afferent volley recorded within the spinal cord after  peripheral nerve stimulation was analyzed around PB/Vh microinjections. 

15 

Materials and Methods 

CHAPTER 2  MATERIALS AND METHODS 

All  protocols  of  the  studies  reported  in  this  thesis  were  approved  by  the  University  of  British Columbia Committee on Animal Care and were carried out in  accordance with the  national  (Canadian  Council  for  Animal  Care,  1993)  and  institutional  (University  of  British  Columbia Committee on Animal Care) guidelines. All the experiments were carried out in  adult  male  Sprague‐Dawley  rats  (290‐590  g),  obtained  from  the  animal  breeding  facility  at  the  University  of  British  Columbia.  The  animals  were  housed  in  standardized  conditions  with  12:12  h  light/dark  cycles  and  ambient  temperature  (21˚C).  The  animals  were  fed  on  standard laboratory rodent chow and given water ad libitum. 

2.1. SURGICAL PROCEDURES 

All  the  surgical  procedures  were  performed  using  aseptic  techniques.  During  surgery  a  deep surgical plane of anesthesia was maintained and monitored. 

2.1.1. Anesthetic Induction 

On  the  day  of  the  experiment,  a  rat  was  weighed  and  placed  in  an  anesthetizing  box  (#  500108, Harvard Apparatus, Holliston, MA) that was supplied with a continuous stream of  isoflurane (4 %) and nitrous oxide (0.6 L/min), in oxygen (3 L/min). The animal usually lost  consciousness  within  1‐2  min,  which  was  confirmed  by  observing  loss  of  righting  reflex.  Once  the  animal  lost  its  righting  reflex,  it  was  taken  out  of  the  chamber  and  placed  on  its  back  on  the  surgery  table.  The  anesthetic  mixture  thereafter  was  delivered  through  a   

16  

Materials and Methods  custom‐made nose cone and the isoflurane level was lowered to 2.5%. The surgical plane of  anesthesia  was  confirmed  with  the  absence  of  blink  and  toe  pinch  reflexes.  The  core  body  temperature  was  maintained  at  37  ±  0.5°C  using  a  feedback‐controlled  heating  blanket.  A  lubricated rectal probe was gently inserted about 1 cm into the rectum and used to monitor  the body temperature throughout the experiment.  

Enrofloxacin (5 mg/kg, i.m.) was administered and lubricating ophthalmic ointment  (Lacrilube®) was applied to the eyes to prevent corneal drying. The ointment was re‐applied  as  needed  throughout  the  experiment.  Warm,  lactated  Ringer’s  solution  was  administered  as a continuous drip (10 mL/kg/h) for the entire length of the experiment through a 24 or 26  gauge  “over  the  needle”  catheter  placed  in  the  lateral  tail  vein.  The  drip  rate  was  intermittently  checked  throughout  the  experiment.  The  flow  of  the  Lactated  Ringer’s  solution was adjusted as needed to compensate for bleeding during surgical manipulations.  The  portion  of  the  tail,  where  the  intravenous  (i.v.)  catheter  was  inserted  was  checked  periodically  to  ensure  proper  i.v.  catheterization.  The  skin  overlying  the  neck,  left  thigh,  back, and head was shaved for surgical manipulations. The shaved skin was disinfected by  serial  application  of  the disinfectants  in  the  following  order:  chlorhexidine  (4%),  isopropyl  alcohol  (70%),  and  povidone  iodine.  Ampicillin  sodium  (33  mg/kg,  slow  i.v.)  and  dexamethasone  (0.6  mg/kg,  slow  i.v.)  were  slowly  administered  through  the  i.v.  catheter.  Heart  rate,  blood  oxygen  levels,  and  end  tidal  CO2  were  continuously  monitored  with  a  pulse oximeter/capnograph (SurgiVet™; Harvard Apparatus, Holliston, MA). The heart rate, 

 

17  

Materials and Methods  oxygen  saturation,  end‐tidal  CO2,  and  core  body  temperature  were  kept  within  normal  physiological limits at all times.  

2.1.2. Tracheotomy 

When  the  animal  was  in  a  surgical  plane  of  anesthesia,  as  confirmed  by  the  absence  of  a  pinch reflex, a partial tracheotomy was performed to allow intubation with an endotracheal  tube. First, a vertical midline incision was made in the shaved skin of the ventral aspect of  the neck. The subcutaneous tissue and sternohyoideus muscles were longitudinally split by  blunt  dissection  and  held  apart  using  a  self‐retaining  retractor  to  expose  the  underlying  trachea. The trachea was carefully dissected from the underlying connective tissue. A partial  transverse incision was made between two tracheal rings rostral to the ring where the suture  threads were tied.  A custom made plastic cannula (ID: 0.05ʺ OD: 0.09ʺ), with a beveled end  was used for tracheal intubation. The beveled end of the cannula was quickly but carefully  inserted through the incision into the trachea. The other end of the cannula was connected  to a mechanical respirator (Inspira; Harvard Apparatus, Holliston, MA) using a Y connector.  The endotracheal tube was secured with sutures placed distal and proximal to the tracheal  incision. The rat was then mechanically ventilated by the respirator after tracheal intubation  for  the  entire  length  of  the  experiment.  Once  the  artificial  ventilation  was  started,  the  isoflurane  level  was  adjusted  between  2  ‐  2.25%,  depending  on  the  depth  of  anesthesia  required  to  complete  the  remaining  surgery.  The  respiration  rate  was  set  between  65‐72  breaths/min. After tracheal intubation, the animal was closely observed for chest expansion.  Blood  oxygen  saturation  as  well  as  an  end  tidal  CO2  readings  between  1.5%  and  2%  were   

18  

Materials and Methods  maintained  at  all  times  throughout  the  experiment  by  adjusting  the  tidal  volume  and  the  respiration  rate  functions  of  the  ventilator.  Once  the  rat  was  stabilized  after  tracheal  intubation, the neck incision was closed using tissue adhesive (Vetbond™; 3M Animal Care  Products, St. Paul, MN). Thereafter, level of anesthesia was checked by observing heart rate,  absence of toe and tail pinch reflexes as well as the eye blink responses. 

2.1.3. Sciatic and Sural Nerve Surgery 

Following tracheal intubation procedures, the animal was placed on its right side to expose  the left sciatic and sural nerves. An incision was made in the shaved skin along the length of  the  femur.  The  skin  around  the  incision  was  carefully  separated  from  the  underlying  connective  tissue  and  fascia.  This  was  followed  by  blunt  dissection  of  the  biceps  femoris  muscles, caudal to the femur to expose the sciatic nerve. Once the sciatic nerve was visible,  the  dissection  was  continued  along  the  gastrocnemius  muscle  and  the  sciatic  nerve  to  expose  the  sural  nerve.  Both  the  nerves  were  carefully  freed  from  the  connective  tissue  in  the popliteal fossa. The incision was irrigated with sterile saline, packed with saline‐soaked  gauze, and closed with the tissue adhesive until the end of the thoracolumbar laminectomy.  

2.1.4. Thoracolumbar Laminectomy 

After peripheral nerve surgery, the animal was placed in prone position. A thoracolumbar  laminectomy  was  then  performed  to  expose  the  spinal  cord  between  the  T13  and  L1  segments.  The  T13  segment  was  identified  by  first  palpating  the  last  floating  rib  at  the  T13  vertebra. Once the T13 vertebra was identified and marked, a midline incision in the shaved 

 

19  

Materials and Methods  skin  of  the  back  was  made  along  length  from  T12  to  L2  vertebrae.  The  adhering  fascia  was  gently separated from the underlying muscles. Paraspinal incisions were made on the either  side of the vertebral column through the muscle layer to the bones extending from T12 to L2  vertebrae.  The  paravertebral  muscles  and  the  underlying  connective  tissue  were  carefully  dissected from the vertebrae. Then the intervertebral space between L1 and L2 vertebrae was  identified.  A  dorsal  laminectomy  was  performed  using  microrongeurs,  starting  from  the  caudal part of the L1 vertebra to the rostral part of the T13 vertebra. Extreme care was taken  to  avoid  damaging  the  underlying  spinal  cord.    After  completion  of  laminectomy,  the  exposed  spinal  segments  were  covered  with  a  piece  of  sterile  calcium  alginate  dressing  (Curasorb™),  soaked  in  sterile  saline.  The  incision  was  temporarily  closed  with  tissue  adhesive.  

2.1.5. Craniotomy 

Following laminectomy procedures, the rat was placed in a stereotaxic frame (Kopf® 1430;  David  Kopf  Instruments,  Tujunga,  CA).  The  head  of  the  rat  was  secured  firmly  to  the  stereotaxic frame with ear bars and a palate bar. A midline incision was made in the scalp  from  the  frontal  bone  to  the  atlanto‐occipital  junction  to  expose  the  calvarium.  The  calvarium was exposed and partially etched with 35% phosphoric acid to clearly reveal the  bregma  (intersection  of  coronal  and  sagittal  sutures)  and  lambda.  The  head  was  firmly  secured in a stereotaxic zero position. Two bilateral trephinations were made in the frontal  bones  to  fix  screws  for  recording  the  cortical  EEG.  A  unilateral  trephination  (~1  mm  diameter) was made in the parietal bone, contralateral to the site of sciatic nerve surgery for   

20  

Materials and Methods  introducing  a  microelectrode  into  the  ventral  posterior  lateral  (VPL)  nucleus  of  the  thalamus. Finally, two trephinations were also made bilaterally along the central suture in  the left and right parietal bones for insertion of microinjection probes into the mesopontine  tegmentum  anesthesia  area  (MPTA).  After  completion  of  surgical  manipulations,  all  the  exposed nerve tissues were covered with warm mineral oil to prevent dehydration. 

2.1.6. T13‐L1 Vertebral Immobilization Procedures 

Following  craniotomy  procedures,  the  laminectomy  site  was  carefully  re‐opened.  The  T12  and L2 vertebrae were tightly secured by two spinal clamps, which in turn, were anchored  to  the  stereotaxic  frame,  so  that  the  exposed  spinal  segment  was  fixed  between  the  two  clamps. The clamps were adjusted so that the spinal cord was held level to the frame with  no  visible  respiration‐induced  movements.  A  recording  well  was  constructed  around  the  exposed spinal segments using denture repair acrylic. The dura of the exposed spinal cord  was gently incised and reflected away from the recording site. The spinal cord was covered  with a small pool of warm mineral oil. 

The  incision  site  of  peripheral  nerve  dissection  was  also  re‐opened.  The  skin  flaps  surrounding  the  incision  were  used  to  form  a  pool  to  contain  warm,  sterile  mineral  oil  bathing  the  exposed  sciatic  and  sural  nerves.  Both  these  nerves  were  carefully  draped  on  small bipolar hook electrodes to synaptically activate recorded STT neurons.  

 

   

21  

Materials and Methods 

2.2. EXTRACELLULAR RECORDING PROCEDURES 

2.2.1. Antidromic Identification of Spinothalamic Tract (STT) Neurons 

The experimental setup scheme for extracellular recording and intracerebral microinjections  procedures  is  depicted  in  Figure  2.1.  A  Parylene‐C®  insulated  monopolar  tungsten  microelectrode  (Catalog  #  573500,  Length:  76  mm,  Diameter:  250 μm,  2  MΩ  AC,  A‐M  Systems, Inc., Sequim, WA), secured to a three axis micromanipulator (Kopf® 1460‐61, David  Kopf Instruments, Tujunga, CA), was directed into the VPL nucleus of thalamus using the  following stereotaxic coordinates: AP: ‐3.0 to –3.5 mm from bregma, ML: 3.0 to 3.3 mm from  the midline, and DV: 5.5 to 7 mm from the dorsal surface of the brain (Palecek et al., 1992;  Paxinos and Watson, 2007). This electrode was used as the antidromic stimulating electrode  for  “backfiring”  STT  neurons.  A  second  monopolar  tungsten  microelectrode,  held  by  a  hydraulic micropositioner (Kopf® 650, David Kopf Instruments, Tujunga, CA), was used for  recording the spike activity of L1 spinal neurons.  

At the beginning of each recording session, both the thalamic stimulation as well as  the  spinal  recording  microelectrodes  were  checked  under  a  microscope  to  ensure  that  electrode  tip  was  perfectly  formed  according  to  the  manufacturer  specifications.  If  the  tip  was even slightly bent, a fresh electrode was used. Care was taken that both the stimulating  and  recording  electrodes  were  held  vertically  straight  against  two  planes  of  the  micropositioner.  

 

22  

Materials and Methods  For  antidromic  identification  of  lumbar  STT  neurons,  a  systematic  search  of  the  exposed spinal segment was carried out. Initially, the stimulation electrode was positioned  in  the  thalamus  at  the  following  stereotaxic  coordinates:  AP:  ‐3.25  mm,  ML:  3.15  mm  and  DV: 6 mm (references: bregma and dorsal surface of the brain). The “zero” position of the  spinal  recording  electrode  was  adjusted  so  that  the  tip  of  the  electrode  just  touched  the  surface  of  the  exposed  spinal  cord  close  to  the  midline  and  contralateral  to  the  thalamic  stimulation site.  

For  antidromic  identification  of  STT  neurons,  low‐intensity  search  stimuli  (0.2  ms,  0.67  Hz,  200‐300  μA)  were  continuously  delivered  to  the  VPL  nucleus  through  the  stimulating electrode while searching the spinal gray matter for the antidromically activated  spikes. While applying search stimuli to the VPL, the recording microelectrode was slowly  lowered  in  5 μm  increments  into  the  exposed  spinal  segment.  The  dorsal‐ventral  advancement of the recording electrode into the spinal cord was controlled using the Kopf®  650 hydraulic micropositioner. Care was taken not to cause spinal cord compression during  the  electrode  descent.  The  microelectrode  was  gradually  lowered  to  a  maximum  depth  of  1800 μm below the dorsal surface of the spinal cord as indicated on the digital display of the  microdrive device. If no antidromic spike was detected, the electrode was slowly retracted  while searching again for an antidromically propagated spike.  

The  spinal  cord  segment  was  systematically  explored  in  grid‐like  fashions  from  a  caudal to rostral direction at 0.5 mm inter‐tract distance. This was carried also out in vertical  tracts,  0.5  mm  lateral  from  each  other  starting  at  the  midline.  Antidromic  spikes  were 

 

23  

Materials and Methods  usually  encountered  when  such  tracking  procedures  were  performed  in  each  anesthetized  rat  preparation.  When  an  antidromically  activated  spike  was  encountered,  the  recording  electrode was moved slowly up or down in 2.5 μm increments until a maximum antidromic  spike  amplitude  was  obtained  (a  minimum  signal‐to‐noise  ratio  of  3:1).  The  depth  of  the  recording electrode corresponding to the maximum antidromic spike amplitude relative to  the  surface  of  the  spinal  cord  was  recorded  as  that  depth  reading  indicated  on  the  digital  display of the micropositioner.  

The  following  criteria  were  used  for  demonstrating  antidromic  activation  of  STT  neurons from VPL nucleus: 1. spike responses with a constant antidromic latency ( 0.05, one‐way ANOVA).  

Further  details  on  the  STT  neuron  groups  and  their  treatment  protocols  are  summarized in Figure 3.4. 

45 

Results   

Axonal Conduction Velocity (m/s)

24 22 20

r = 0.07 18 16 14 12 0

200

400

600

800

1000 1200 1400 1600 1800

Spinal Recording Depth (μm)

 

Figure 3.3  Correlation  between  axonal  conduction  velocity  and  spinal  recording  depth  of  STT neurons. The abouve figure depicts scatter plot of axonal conduction velocity (m/s) and  the  respective  spinal  recording  depths  (μm)  of  18  antidromically  identified  STT  neurons.  The coefficient of correlation (r) was 0.07. Note that no significant correlation exists between  the two parameters (p = 0.8, Pearson’s correlation). 

46 

Results 

  Measurement of SFR, FI, Sc‐Su ER of STT neuron  

   

Group I (n =6) 

Group II (n = 6) 

Group III (n = 6) 

 

Vh 

PB 

Vh 

 

Microinjections 

Microinjections 

Microinjections 

Recording of SFR, FI 

Recording of SFR, FI 

Recording of SFR, FI 

and Sc‐Su ER at 2, 15, 

and Sc‐Su ER at 2, 15, 

and Sc‐Su ER at 2, 15, 

30 and 60 min after Vh 

30 and 60 min after PB 

30 and 60 min after Vh

microinjections 

microinjections 

microinjections 

 

          Recovery period 

 

(~ 60 min) 

   

PB microinjections 

   

Recording of SFR, FI and 

 

Sc‐Su ER at 2, 15, 30 and 60  min after PB 

   

End of the experiment 

  Figure 3.4 Schematic explanation of STT neurons classified into three groups based on the  treatment(s) they received.  Legend:  FI  –  firing  index,  PB  –  pentobarbital,  SFR  –  spontaneous  firing  rate,  Sc‐Su  ER  ‐  sciatic and sural nerve‐evoked responses, Vh – vehicle control solution 

47 

Results 

3.2.2. ELECTROPHYSIOLOGICAL PARAMETERS AT THE BASELINE 

After  a  STT  neuron  was  isolated  and  identified,  all  the  electrophysiological  parameters  (SFR, FI, Su‐ER and Sc‐ER) were measured before the microinjections of Vh and/or PB. The  values  for  each  of  these  parameters  served  as  baseline  values  for  comparison  with  those  obtained after microinjections of Vh and/or PB.  

3.2.2.1. Spontaneous Firing Rate  

All  the  STT  neurons  examined  in  this  thesis  were  found  to  be  spontaneously  active.  For  determining  the  baseline  spontaneous  firing  rate  (SFR),  two  distinct  epochs  from  the  STT  spike waveform of 2 min each were selected. The SFR (in spikes/s) obtained from each of the  epochs were averaged to obtain the final baseline SFR. The SFR at the time points following  the  microinjections  were  compared  against  this  baseline  SFR.  The  group  mean  (±  SEM)  baseline  SFR  of  all  the  18  STT  neurons  was  13.1  ±  2.1  spikes/s  (range:  4  ‐  40).  The  group  mean (± SEM) baseline SFR of Group I, Group II and Group III STT neurons were 8.6 ± 2.1  spikes/s (range: 4 – 18), 11.8 ± 2.9 spikes/s (range: 5 ‐ 22), and 19 ± 4.7 spikes/s (range: 11 –  40), respectively. 

A  statistical  comparison  between  the  baseline  SFR  of  the  three  groups  showed  no  significant differences (F(2, 15) = 2.7, p = 0.12, one‐way ANOVA). 

To determine if baseline SFR of all 18 STT neurons depended on the depth at which  they  were  recorded,  a  Pearson’s  correlation  analysis  was  performed  between  these  two  parameters.  As  shown  in  the  Figure  3.5A  no  statistically  significant  correlation  existed 

48 

Results  between  these  two  parameters  (r(16)  =  0.33,  p  =  0.18,  Pearson’s  correlation).  Similarly,  the  correlation  analysis  between  the  baseline  SFR  and  axonal  conduction  velocity  of  all  the  eighteen  STT  neurons  revealed  no  significant  relationship  (Fig.  3.5B,  r  =  0.39,  p  >  0.05,  Pearson’s correlation). 

 

3.2.2.2. Antidromic Firing Index  

The group mean ± SEM baseline FI of all the 18 STT neurons was 87.9 ± 3.3 (range: 53‐100).  The group mean (± SEM) baseline FI of Group I, Group II and Group III STT neurons were  82.3  ±  6.1  (range:  63  ‐  99),  88.9  ±  7.4  (range:  53  ‐  100)  and  93.8  ±  2.1  (range:  86  ‐100),  respectively. 

The baseline FI of the three groups did not differ significantly from each other (F(2,  15) = 1.04, p = 0.38, one‐way ANOVA). 

 

3.2.2.3. Peripheral Nerve‐Evoked STT Responses 

Of 18 STT neurons, no orthodromic responses could be elicited in 2 STT neurons  (# 7 and 8)  with  either  sural  or  sciatic  nerve  stimulation  despite  a  gradual  increase  in  the  stimulus  intensity.  In  case  of  one  STT  neuron  (#  9),  only  sural  nerve‐evoked  responses  could  be  recorded while for another STT neuron (# 11), only sciatic nerve‐evoked responses could be  recorded. Thus, sural and sciatic nerve‐evoked responses were recorded and measured in 15  of 18 STT neurons.  

49 

Results   

A. Baseline SFR (spikes/s)

50 40 30

r = 0.33

20 10 0 0

200

400

600

800

1000 1200 1400 1600 1800

Spinal Recording Depth (μm)

B. Baseline SFR (spikes/s)

50 40 30

r = 0.39

20 10 0 0

5

10

15

Axonal conduction velocity (m/s)

20

25

 

Figure 3.5 Correlation of baseline spontaneous firing rate with spinal recording depth and  axonal conduction velocity of STT neurons. The graph in A depicts relationship between the  spontaneous  firing  rate  (SFR,  spikes/s)  of  STT  neurons  (n  =  18)  and  their  respective  recording  depth  (μm)  within  the  spinal  gray  matter.  The  graph  in  B  shows  relationship  between  the  SFR  of  18  STT  neurons  and  their  respective  axonal  conduction  velocity  (m/s).  The lines of best fit are drawn through the points. Respective correlation coefficients (r) are  denoted  on  the  right  side  of  each  graph.  Note  that  there  was  no  significant  correlation  between these parameters (p > 0.05, Pearson’s correlation). 

50 

Results 

3.2.2.3.1. Sural Nerve‐Evoked STT Responses 

Of 18 STT  neurons recorded in  this  project, responses  of 15  STT  neurons  to  stimulation  of  sural  nerve  were  observed.  For  three  STT  neurons  (#  7,  8  and  11),  no  response  could  be  elicited with sural nerve stimulation despite a gradual increase in the stimulus intensity. 

The threshold intensity for sural nerve stimulation was determined as the minimum  stimulus  intensity,  required  to  produce  a  single  or  short  train  of  orthodromic  action  potentials.  The  mean  (±  SEM)  threshold  intensity  for  sural  nerve  stimulation  was  1.8  ±  0.4  mA (range: 0.2 ‐ 5). A typical sural nerve stimulation‐evoked STT response is illustrated in  the Figure 3.6B.  

 

Baseline  sural  nerve  stimulation‐evoked  responses  (Su‐ER)  of  STT  neurons  were 

recorded  and  measured  before  the  microinjections.  The  baseline  group  mean  (±  SEM)  magnitude of the Su‐ER of 15 STT neurons measured 7.4 ± 1.2 spikes/trial (range: 2 ‐ 18). The  corresponding group  mean (±  SEM)  response‐to‐latency  measured  15 ±  2.8  ms (range: 13 ‐  18). The group means (± SEM) of the baseline response magnitude of Su‐ER of Group I (n =  5),  Group  II  (n  =  6)  and  Group  III  (n  =  4)  STT  neurons  were  6  ±  2  (range:  2  ‐  14),  8.8  ±  2.3  (range: 3 ‐ 18) and 7.1 ± 1.1 (range: 4 ‐ 10) spikes/trial, respectively. The baseline values for  the response magnitude of the three groups did not differ significantly from each other (F(2,  12) = 0.53, p = 0.6, one‐way ANOVA). The response latencies of Group I, Group II and Group  III  STT  neurons  were  14.8  ±  5.9  (range:  13  ‐  17),  16.1  ±  5.2  (range:  15  ‐  18)  and  14 ±  2.9  ms  (range: 13 ‐ 15), respectively. The baseline values for the response latency of the three groups  did not differ significantly from each other (F(2, 12) = 0.04, p = 0.96, one‐way ANOVA). 

51 

Results   

Previous  studies  have  shown  that  repetitive  application  of  peripheral  stimuli  can 

lead  to  suppression  of  spinal  neurons,  called  the  habituation  phenomenon  (Griffin  and  Pearson, 1967; Macdonald and Pearson, 1979). To test if repetitive stimulation of sural nerve  in  the  present  study  underwent  a  habituation  phenomenon,  the  magnitude  of  synaptic  responses  of  five  STT  neurons  to  the  first,  second,  third,  fourth  and  fifth  batteries  of  ten  consecutive stimuli as well as to a total battery of fifty consecutive stimuli were compared.  As shown in the Figure 3.7 there were no significant differences between the magnitudes of  Su‐ER  STT  responses  obtained  from  five  individual  batteries  of  ten  stimuli  (p  >  0.05,  one‐ way repeated measures ANOVA). Similarly, when response magnitudes obtained from all  the five batteries  of ten trials were  compare  with  one  battery  of fifty  stimuli  no  significant  differences were found (p > 0.05, one‐way repeated measures ANOVA). This data indicates  that repetitive stimulation of sural nerve did not undergo habituation of evoked responses  of STT neurons and thus provided stable baseline response.  

   

 

 

 

 

52 

Results 

 

  Figure  3.6  Example  of  sural  nerve‐evoked  STT  responses.  The  upper  left  trace  (A)  shows  antidromic  spike  of  a  STT  neuron  recorded  in  the  L1  spinal  segment  after  single  pulse  (S)  stimulation in the thalamus. The upper right trace (B) shows orthodromic responses of the  same  STT  neuron  evoked  after  single  pulse  (S)  stimulation  (0.1  ms,  0.9  mA)  of  the  sural  nerve  (B).  Post  stimulus  time  histograms  (bin  width:  0.5  ms)  of  the  antidromic  spike  (50  trials) and sural nerve‐evoked response (1 trial) are shown in the bottom traces (C and D),  respectively. The insets in A and B are voltage and time calibration lines.         

53 

Results  14

Number of spikes/trial

12 10 8 6 4 2 0 1-10

11-20

21-30

31-40

Stimulus Trials

41-50

1-50

 

 

Figure  3.7  Absence  of  habituation  of  sural  nerve‐evoked  STT  responses.  The  sural  nerve  was  stimulated  using  the  intensity  2  times  the  threshold  intensity.  The  first  five  bars  represent the group mean (± SEM) response magnitude (number of spikes/trial) of five STT  neurons obtained from five consecutive batteries of sural nerve stimulation, each consisting  of 10 stimulus trials. The last bar represents group mean (± SEM) response magnitude of five  STT neurons obtained from one battery of sural nerve stimulation consisting of 50 stimulus  trials. Note that there were no differences among the magnitude of responses obtained from  small number (10) of trials as well as large number (50) of trials (p > 0.05, one‐way repeated  measures ANOVA).       

 

 

 

 

54 

Results 

3.2.2.3.2. Sciatic Nerve‐Evoked STT Responses  

The  threshold  intensity  for  sciatic  nerve  stimulation  was  determined  as  the  minimum  stimulus  intensity,  required  to  produce  a  single  or  short  train  of  orthodromic  action  potentials.  Out  of  18  STT  neurons,  responses  of  15  STT  neurons  were  recorded  after  stimulation of sciatic nerve. In three STT neurons (# 7, 8 and 9), no response could be elicited  with sciatic nerve stimulation despite a gradual increase in the stimulus intensity. The mean  (± SEM) threshold intensity for sciatic nerve stimulation was 1.4 ± 0.7 mA (range: 0.08 ‐ 10).  

A typical Sc nerve stimulation‐evoked response (Sc‐ER) of a STT neuron is illustrated  in  the  Figure  3.8B.  Note  that  the  cellular  response  for  this  particular  neuron  consisted  of  “early” and “late” polysynaptic components, although this was observed for only three STT  neurons examined. 

The  group  mean  (±  SEM)  magnitude  and  latency  of  the  Sc‐ER  (at  2  times  the  threshold intensity) of 15 STT neurons measured 8.1 ± 1.5 spikes/trail (range: 1 ‐ 17) and 44.8  ±  1.8  ms  (range:  31  ‐  54),  respectively.  The  group  means  (±  SEM)  of  the  baseline  response  magnitudes of Group I (n = 5), Group II (n = 6) and Group III (n = 4) STT neurons measured  6.3  ±  2.3  (range:  3  ‐  15),  9.7  ±  2.8  (range:  1  ‐  17)  and  8.1  ±  1.2  spikes/trial  (range:  5  ‐  11),  respectively.  The  baseline  values  for  the  response  magnitude  of  the  three  groups  did  not  differ  significantly  from  each  other  (F(2,  12)  =  0.51,  p  =  0.61,  one‐way  ANOVA).The  group  means (± SEM)  of the baseline  response latencies of Group  I,  Group  II,  and  Group  III STT  neurons  measured  47.2  ±  2.4  (range:  44  ‐  54),  42.3  ±  3.6  (range:  31  ‐  54)  and  44.5  ±  0.5  ms  (range:  43  ‐  46),  respectively.  The  baseline  values  for  the  response  latency  of  all  the  three 

55 

Results  groups  did  not  differ  significantly  from  each  other  (F(2,  12)  =  0.78,  p  =  0.48,  one‐way  ANOVA). 

To determine if repetitive stimulation of Sc nerve in the present study underwent a  habituation  phenomenon  (Griffin  and  Pearson,  1967;  Macdonald  and  Pearson,  1979),  the  response magnitude of five STT neurons to the first, second, third, fourth and fifth batteries  of  ten  consecutive  stimuli  with  a  battery  comprising  of  fifty  consecutive  stimuli  were  compared.  As  shown  in  the  Figure  3.9  there  were  no  significant  differences  between  the  response magnitudes of obtained from five individual batteries of ten stimuli (p > 0.05, one‐ way repeated measures ANOVA) as well as with one battery of fifty stimuli (p > 0.05, one‐ way repeated measures ANOVA). This data indicates that repetitive stimulation of Sc nerve  did not undergo habituation of evoked responses of STT neurons and thus provided stable  baseline response.  

56 

Results 

Figure 3.8 Example of sciatic nerve‐evoked STT responses. The upper left trace (A) shows  antidromic spike (arrow) of a STT neuron evoked in the L1 spinal segment after single pulse  (S)  stimulation  in  the  thalamus.  The  upper  right  trace  (B)  shows  orthodromic  responses  (arrows) of the same STT neuron evoked after single pulse (S) stimulation (0.1 ms, 1.5 mA)  of  the  sciatic  nerve.  Post  stimulus  time  histograms  (bin  width:  0.5  ms)  of  the  antidromic  spike (50 trials) and sciatic nerve‐evoked response (1 trial) are shown in the bottom traces (C  and D), respectively. The insets in A and B are voltage and time calibration lines.        

 

57 

Results   

Number of spikes/trial

8

6

4

2

0 1-10

11-20

21-30

31-40

Stimulus trials

41-50

1-50  

  Figure 3.9 Absence of habituation of sciatic nerve‐evoked STT responses. The sciatic nerve  was  stimulated  using  the  intensity  2  times  the  threshold  intensity.  The  bars  represent  the  group  mean  (±  SEM)  response  magnitude  (number  of  spikes/trial)  of  five  STT  neurons  obtained  from  five  consecutive  batteries  of  sciatic  nerve  stimulation,  each  consisting  of  10  stimuli as well as a single battery of 50 stimulus trials. Note that there were no differences  among  the  magnitude  of  responses  obtained  from  small  number  (10)  of  trials  as  well  as  large number (50) of trials (p > 0.05, one‐way repeated measures ANOVA).     

58 

Results 

3.2.3.  EFFECTS  OF  BILATERAL  MICROINJECTIONS  OF  VEHICLE  CONTROL  SOLUTION/PENTOBARBITAL 

INTO 

THE 

RAT 

MPTA 

ON 

THE 

ELECTROPHYSIOLOGICAL PARAMETERS OF STT NEURONS 

  3.2.3.1. MICROINJECTIONS OF VEHICLE CONTROL SOLUTION  

In the present study, aqueous vehicle containing 10% ethanol and 20% propylene glycol as  co‐solvents  was  used  to  dissolve  PB  (Devor  and  Zalkind,  2001).  Ethanol  itself  can  exert  differential  effects  in  the  CNS,  including  analgesia  (James  et  al.,  1978;  Woodrow  and  Eltherington,  1988).  Further,  ethanol  is  shown  to  suppress  the  excitability  of  primary  sensory neurons (Oakes and Pozos, 1982; Nieminen, 1987; Gruss et al., 2001).  On the other  hand, subcutaneous microinjection of ethanol has been shown to increase the sensitivity of  dorsal horn sensory neurons (Carstens, 1997). Accordingly, to examine if the vehicle control  solution (Vh) itself had any effect on the ongoing as well as evoked spike activity of the STT  neurons, all of the three electrophysiological parameters of the STT neurons were compared  before and after microinjections of PB‐free vehicle into the MPTA.  

3.2.3.1.1. Spontaneous Firing Rate: Vehicle Control Microinjections 

To determine if changes in the mean SFR of the STT neurons occurred after microinjections  of Vh (1 μL/side) into the MPTA, the SFR at time point (2, 15, 30 and 60 min) following Vh  microinjections  was  compared  with  the  baseline  SFR.  Figure  3.10  summarizes  the  group  mean (± SEM) SFR of Group I (A, n = 6) and Group III (B, n = 6) STT neurons as well as their 

59 

Results  combined SFR (Vh, n = 12) before and following microinjections of Vh. Comparisons of SFR  at each of the time points after Vh microinjections with the respective baseline SFR showed  no  significant  change  for  STT  neurons  in  the  Group  I  and  Group  III  or  when  their  results  were combined (p > 0.05, paired Student’s t test).  

 

The  SFR  of  each  STT  neuron  in  the  Group  I,  Group  III  before  and  after  Vh 

microinjection  are  illustrated  in  the  Figure  3.11.  Figure  3.12  illustrates  a  typical  rate‐meter  histogram  trace  showing  the  firing  rate  of  a  STT  neuron  before  and  following  control  microinjections.  

   

 

 

    

60 

Results 

Group III (n = 6)

B.

Group I (n = 6) 16

30

14

25

12

SFR (spikes/s)

SFR (spikes/s)

A.

10 8 6 4 2

20 15 10 5

Vh

Vh

0

0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

SFR (spikes/s)

C.

60

-30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

Combined SFR (Groups I and III, n = 12) 25 20 15 10 5

Vh

0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

 

Figure 3.10 Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA of  isoflurane‐anesthetized rat preparation on the spontaneous firing rate of STT neurons. Time  relative to zero is indicated in minutes. Each bar in each graph represents the group mean (±  SEM)  spontaneous  firing  rate  (SFR,  spikes/s).  The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  point  where  the  baseline  SFR  was  measured  before  vehicle  control  solution (Vh; 1 μL/side) microinjections. The graphs in A (open bars) and B (grey bars) show  SFR of Group I and Group III STT neurons, respectively. The graph in C (black bars) shows  the group mean (± SEM) combined SFR of the Groups I and III STT neurons. Note that the  SFR following Vh microinjections in any of the groups as well as in the combined results did  not change significantly compared to the baseline SFR (p > 0.05, paired Student’s t test).          

61 

Results 

A. Group I (n = 6)

STT 6 STT 9 STT 10 STT 11 STT 15 STT 18

SFR (spikes/s)

40 30 20 10 0

Vh -30

2 15 30 Time Points (min)

60

B. Group III (n = 6)

STT 7 STT 8 STT 12 STT 14 STT 17 STT 19

50

SFR (spikes/s)

40 30 20 10 0

Vh -30

2 15 30 Time Points (min)

60

Figure  3.11  Spontaneous  firing  rate  of  each  STT  neuron  before  and  after  bilateral  microinjections  of  vehicle  control  solution  into  the  MPTA  of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation.  The  Figure  shows  spontaneous  firing  rate  (SFR,  spikes/s)  of  each  of  the  STT  neurons in Group I (A) and Group III (B). The time point ‐30 min in each graph represents  the time point where the baseline SFR was measured before vehicle control solution (Vh; 1 μL/side)  microinjections.  The  downward  arrow  indicates  time  zero  corresponding  to  the  time of completion of the microinjections.  

62 

 

   

 

Figure 3.12 Example of a continuous ratemeter histogram trace depicting the spontaneous firing rate of a STT neuron before and  following  bilateral  microinjections  of  vehicle  control  solution  into  the  MPTA.  The  completion  of  microinjections  of  vehicle  control  solution (Vh, 1 μL/side) is denoted by the upward arrow at the bottom of the trace. A sliding average (white line; bin width: 30 s) is  superimposed over the rate histogram trace (bin width: 1 s). Spontaneous firing rate (SFR; spikes/s) at the baseline (SFRB) and at 2  min  (SFR2),  15  min  (SFR15),  30  min  (SFR30),  and  60  min  (SFR60)  following  Vh  microinjections  are  noted  abouve  the  trace.  Note  that  following microinjections of Vh, the firing rate does not change significantly from the baseline. 

Results

63

 

Results 

3.2.3.1.2. Interspike Interval Data: Vehicle Control Microinjections 

To determine if the microinjections of the vehicle control solution caused any change in the  firing  pattern  of  the  STT  neurons,  the  interspike  interval  histograms  (ISIH),  as  well  as  the  coefficient of variation (CV) and dispersion (CD) were analyzed. To construct ISIHs at each  time  point,  the  same  data  files  were  used  that  were  used  for  determining  the  SFR.  The  results of the interspike interval data analysis of the Groups I and III STT neurons as well as  their combined results are summarized in the Table 3.1.  

 

The  ISIH  distributions  were  leptokurtic  and  in  the  10  of  the  12  neurons  positively 

skewed.  Since  the  ISIH  distributions  were  skewed,  median  interval  rather  than  mean  interval  was  measured  and  analyzed.  The  overall  analysis  of  the  interspike  interval  data  revealed no significant changes after microinjections of Vh.  

 

Similarly,  the  CV  and  CD,  which  are  measures  of  spike  train  irregularity  (Cocatre‐

Zilgien  and  Delcomyn,  1992;  Soja  et  al.,  1996),  were  not  altered  by  vehicle  control  microinjections  (p  >  0.05,  paired  Student’s  t  test).  Collectively,  these  data  indicate  that,  microinjections of vehicle control solution into the MPTA did not change the firing pattern  of the recorded STT neurons.  

 

An  example  of  ISIH  distribution  of  the  spike  activity  of  a  STT  neuron  before  and 

after microinjections of vehicle control solution into the MPTA is represented in Figure 3.13. 

 

 

64 

 

Figure 3.13 Example of interspike interval histogram (ISIH) distributions of spike activity of a lumbar STT neuron recorded before  and  after  bilateral  microinjections  of  vehicle  control  solution  into  the  MPTA  of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation.  Each  ISIH  was  constructed  from  2  min  epoch  of  the  spike  activity  recorded  before  (Baseline)  and  at  each  time  point  (2,  15,  30  and  60  min)  following  microinjections  of  vehicle  control  solution  (Vh;  1  μL/side).  The  median  intervals  are  indicated  by  dashed  vertical  lines.  Computer‐generated  spike  trains  (5  s)  for  the  respective  time  points  are  shown  as  insets.  The  time  calibration  bars  (500  ms)  are  Results

shown below each spike train. Note that the spike pattern of this cell did not change following microinjections of Vh.

65

Results 

    Interspike  Interval  Parameter  Median  Interval  (ms) 

CV 

CD 

STT  Neuron  Group  I (n = 6) 

Baseline 

Minutes after vehicle control (1 μL/side)  microinjections  2  15  30  60 

28.3 ± 2.3 

30 ± 2.7  30.3 ± 3.9

III (n = 6) 

33.3 ± 7 

31.5 ± 4.7

33 ± 10 

27 ± 5.6 

27.7 ± 2.2

34.2 ± 7.1  31.1 ± 4.9

Combined   30.8 ± 8.9  33.3 ± 2.3 31.7 ± 3.8 34.6 ± 5.3  29.4 ± 2.5 I and III  I (n = 6) 

0.8 ± 0.1 

0.8 ± 0.1

0.7 ± 0.1 

0.8 ± 0.1 

1 ± 0.2 

III (n = 6) 

0.8 ± 0.1 

0.8 ± 0.1

0.8 ± 0.1 

0.8 ± 0.1 

0.8 ± 0.1 

Combined  I and III 

0.8 ± 0.1 

0.8 ± 0.1

0.8 ± 0.1 

0.8 ± 0.1 

0.8 ± 0.0 

I (n = 6) 

0.1 ± 0.1 

0.1 ± 0.1

0.2 ± 0.1 

0.2 ± 0.1 

0.2 ± 0.1 

III (n = 6) 

0.1 ± 0.0 

0.1 ± 0.1

0.1 ± 0.3 

0.1 ± 0.1 

0.1 ± 0.1 

Combined  I and III 

0.1 ± 0.0 

0.1 ± 0.0

0.3 ± 0.2 

0.1 ± 0.0 

0.1 ± 0.2 

  Table 3.1 Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into the  MPTA  of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  interspike  interval  parameters  of  STT  neurons. The table summarizes results of interspike interval analysis of Groups I and III STT  neurons  as  well  as  their  combined  data  before  (baseline)  and  at  the  four  time  points  after  microinjections of control vehicle solution (1 μL/side). Each parameter is represented as the  group  mean  (±  SEM).  Note  that  none  of  the  interspike  interval  parameters  changed  significantly following Vh microinjections (p > 0.05, paired Student’s t test).  CV: coefficient of variation; CD: coefficient of dispersion     

66 

Results 

3.2.3.1.3. Antidromic Firing Index: Vehicle Control Microinjections  

To assess the effects of bilateral microinjections of Vh into MPTA on the excitability of STT  neurons,  the  FI  at  various  time  points  (2,  15,  30  and  60  min)  after  the  microinjections  was  compared with the baseline FI. 

As shown in Figure 3.14 there was no significant change in the group mean (± SEM)  FI  of  Group  I  (Fig.  3.14A;  n  =  6)  and  Group  III  (Fig.  3.14B;  n  =  6)  STT  neurons  after  microinjections  of  Vh  when  compared  to  their  respective  baseline  FI  (p  >  0.05,  paired  Student’s t test). When the data from these two groups were combined (Fig. 3.14C; n = 12),  the  mean  FI  also  remained  unchanged  following  microinjections  of  Vh  when  compared  to  the baseline FI (p > 0.05, paired Student’s t test). 

The  FI  of  each  STT  neuron  in  the  Groups  I  (A;  n  =  6),  and  III  (B;  n  =  6)  before  and  following Vh microinjections are presented in the Figure 3.15.  

The  overall  results  indicate  that  the  antidromic  firing  index  (FI)  and  thus  the  excitability of STT neurons was not significantly altered following microinjections of vehicle  control solution into MPTA (p > 0.05, paired Student’s t test). 

   

 

 

67 

Results 

A.

B.

Group I (n = 6)

Group III (n = 6)

100

120

80

100 80 FI

FI

60 40

60 40

20

20

Vh

0

Vh

0 -30

0

2

15

30

60

-30

0

Time Points (min)

C.

2 15 30 Time Points (min)

60

Combined FI (Groups I and III, n = 12) 100 80

FI

60 40 20

Vh

0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

Figure 3.14 Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA on  the  antidromic  firing  index  of  STT  neurons  in  the  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation.  Time relative to zero, is indicated in minutes. Each bar in each graph represents the group  mean  (±  SEM)  firing  index  (FI).  The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  point  where  the  baseline  FI  was  measured  before  vehicle  control  solution  (Vh;  1 μL/side)  microinjections.  The  graphs  in  A  (open  bars)  and  B  (grey  bars)  show  FI  of  Group  I  and  Group III STT neurons, respectively. The graph in C (black bars) shows the group mean (±  SEM) SFR combined FI in Group I and Group III STT neurons. Note that the FI following Vh  microinjections  in  any  of  the  Groups  I  and  III  as  well  as  in  the  combined  results  did  not  change significantly compared to the baseline (p > 0.05, paired Student’s t test). 

     

68 

Results   

A. Group I (n = 6) STT - 6 STT - 9 STT - 10 STT - 11 STT - 15 STT - 18

120 100

FI

80 60 40

Vh

20 -30

2 15 30 Time Points (min)

60

B. Group III (n = 6)

STT - 7 STT - 8 STT - 12 STT - 14 STT - 17 STT - 19

110 100

FI

90 80 70 60

Vh

50 -30

2

15

30

Time Points (min)

60

 

Figure  3.15 Antidromic  firing  index  of  each  STT  neuron  before  and  after  bilateral  microinjections  of  vehicle  control  solution  into  the  MPTA  of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation.  The  figure  depicts  antidromic  firing  index  (FI)  of  each  of  the  STT  neurons  in  Group  I  (A)  and  Group  III  (B).  The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  when  baseline  antidromic  firing  index  FI  was  measured  before  vehicle  control  solution  (Vh;  1 μL/side)  microinjections.  The  downward  arrow  indicates  time  zero  corresponding  to  the  time of completion of the microinjections.  

69 

Results 

3.2.3.1.4. Sural Nerve‐Evoked STT Responses: Vehicle Control Microinjections  

Out  of  18  STT  neurons  recorded,  sural  nerve  stimulation  could  elicit  responses  in  15  STT  neurons. In three neurons, no responses could be elicited by sural (Su) nerve stimulation. Of  the 15 STT neurons, 9 STT neurons were assessed for their responses to the stimulation of Su  nerve before and following microinjections of Vh.  

As  shown  in  Figure  3.16,  the  microinjection  of  Vh  did  not  alter  the  response  magnitude  as  well  as  the  latency  of  Su‐ER  of  STT  neurons  whether  it  was  Group  I  (Fig.  3.16A), Group III (Fig. 3.16.B), or combined data set (Fig. 3.16C) (p > 0.05, paired Student’s t  test).   

To examine if microinjections of Vh altered the presynaptic afferent input to the STT  neurons,  the  peak‐trough  amplitude  analysis  of  the  afferent  volley  recorded  within  the  spinal cord after Su nerve stimulation were performed. Figure 3.17 illustrates an example of  presynaptic  afferent  volley  recorded  in  the  spinal  cord  followed  by  a  compound  action  potential evoked by Su nerve stimulation. As shown in the Figure 3.18, both the peak height  as  well  as  latency  did  not  change  significantly  following  microinjections  of  Vh  (p  >  0.05,  paired Student’s t test). 

To summarize, both the magnitude as well as latency of responses of STT neurons to  stimulation of the Su nerve were not significantly altered following bilateral microinjections  of Vh into the MPTA.  The afferent volley arising as a consequence of Su nerve stimulation  also did not change following Vh microinjections into the MPTA. 

70 

Results                        Response Magnitude                                             Mean Latency  Group I (n = 5) 30

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Mean Latency (ms)

Spikes / Trial

A.

C

Vh

20 15 10 Vh

5 0

-30

0

2

15

30

60

-30

0

Time Points (min)

B.

15

30

60

30

60

30

60

Group III (n = 4) 25 Mean Latency (ms)

8 6 4 2

Vh C

20 15 10 5

Vh

0

0 -30

0

2

15

30

60

-30

0

Time Points (min)

C.

2

15

Time Points (min)

Combined (Groups I and III, n = 9) 14

25 Mean Latency (ms)

12 Spikes / Trial

2

Time Points (min)

10 Spikes / Trial

25

10 8 6

C

4 Vh

2 0 -30

0

2

15

Time Points (min)

30

60

20 15 10 5

Vh

0 -30

0

2

15

Time Points (min)

Figure 3.16 Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA of  the  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  sural  nerve‐evoked  responses  of  STT  neurons. Time relative to zero is indicated in minutes. Each bar in each graph represents the  group  mean  (±  SEM)  value.  The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  at  which the baseline response was measured before microinjections of vehicle control solution  (Vh;  1  μL/side).  The  response  magnitudes  (spikes/trial)  and  response  latencies  (ms)  are  represented in the left and right panels, respectively. Graphs in A and B represent results of  Groups  I  and  III  STT  neurons,  respectively.  The  graphs  in  C  show  combined  values  of  Group I and Group III. In all cases, p > 0.05, paired Student’s t test.

71 

Results 

B.

Peak height (μV)

A.

Peak latency (ms)

S

0.1 μ V 1 ms

S

0.2 μV 5 ms

Figure  3.17  Example  of  presynaptic  afferent  volley  recorded  in  the  spinal  cord  evoked  by  stimulation of sural nerve. The sural nerve was stimulated at 2 times the threshold intensity,  which was the minimum intensity required to produce a single or short train of orthodromic  action potentials. The stimulus (S) applied to the sural nerve is followed by afferent volley  (enclosed  in  the  box),  which  in  turn,  is  followed  by  a  compound  action  potential  (A).  The  trace shown in the upper right (B) is time and amplitude expanded portion of the stimulus  and afferent volley.  

72 

Results                     Peak‐Trough Amplitude                                        Latency  A.

Group I (n = 5) 4

0.7

0.5

Latency (ms)

Peak Height (μV)

0.6

0.4 0.3 0.2 0.1

2 1

Vh

Vh

0.0

0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

B.

60

-30

4

0.6

3

0.4

2 15 30 Time Points (min)

60

0.2

2 1

Vh

Vh

0.0

0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

C.

60

-30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

Combined (Groups I and III, n = 9) 0.7

3.5

0.6

3.0

0.5

2.5

Latency (ms)

Peak Height (μV)

0

Group III (n = 4) 0.8

Latency (ms)

Peak Height (μV)

3

0.4 0.3 0.2 0.1

2.0 1.5 1.0 0.5

Vh

0.0

Vh

0.0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

-30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

Figure 3.18 Effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA of  the  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  sural  nerve‐evoked  afferent  volley  recorded  in the lumbar spinal cord of isoflurane‐anesthetized rat preparation. Time relative to zero is  indicated in minutes. Each bar in each graph represents the group mean (± SEM) value. The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  at  which  the  baseline  response  was  measured before microinjections of vehicle control solution (Vh; 1 μL/side).The peak‐trough  amplitudes (μV) and latencies (ms) of afferent volley are shown in the left and right panels,  respectively.  The  graphs  in  A  and  B  represent  results  of  Groups  I  and  III  STT  neurons,  respectively. The graphs in C show combined values of Group I and Group III. In all cases, p  > 0.05, paired Student’s t test. 

73 

Results 

3.2.3.1.5. Sciatic Nerve‐Evoked STT Responses: Vehicle Control Microinjections  

Of  the  18  STT  neurons  recorded,  sciatic  (Sc)  nerve  stimulation  could  elicit  responses  in  15  STT  neurons.  In  three  neurons  (#  7,  8  and  9),  no  responses  could  be  elicited  by  Sc  nerve  stimulation. Of the 15 STT neurons, 9 STT neurons were assessed for their responses to the  stimulation of Sc nerve before and following microinjections of Vh.  

As shown in Figure 3.19, microinjections of Vh did not alter the response magnitude  or  latency  of  Sc‐ER  of  STT  neurons  whether  the  neurons  were  from  Group  I  (Fig.  3.19A),  Group III (Fig. 3.19B), or combined data sets (Fig. 3.19C) (p > 0.05, paired Student’s t test).   

To examine if microinjections of Vh altered the presynaptic afferent input to the STT  neurons,  the  peak‐trough  amplitude  analysis  of  the  afferent  volley  recorded  within  the  spinal cord after Sc nerve stimulation were performed. Figure 3.20 illustrates an example of  presynaptic  afferent  volley  recorded  in  the  spinal  cord  followed  by  a  compound  action  potential  evoked  by  Sc  nerve  stimulation.  The  peak‐trough  amplitude  and  latency  of  the  afferent volleys were compared before and after microinjection. As shown in the Figure 3.21,  both  the  amplitude  as  well  as  latency  of  the  afferent  volley  did  not  change  significantly  following microinjections of Vh (Fig. 3.21; p > 0.05, paired Student’s t test). 

 

To summarize, both the magnitude as well as latency of responses of STT neurons to 

stimulation of the Sc nerve were not significantly altered following bilateral microinjections  of Vh into the MPTA. The afferent volley arising as a consequence of Sc nerve stimulation  also did not change following Vh microinjections into the MPTA.

74 

Results  Taken together, the results of the present study indicate that bilateral microinjections  of  vehicle  control  solution  into  the  MPTA  did  not  alter  all  the  four  electrophysiological  parameters (i.e. SFR, FI, Su‐ and Sc‐ER) of STT neurons recorded, thus establishing a good  control. 

Tables  3.2  through  3.4  summarize  the  results  of  effects  of  microinjections  of  Vh  on  the electrophysiological parameters of STT neurons recorded in this study.  

                           

75 

Results 

                       Response Magnitude                                  Response Latency  A. 10

60

8

50

Latency (ms)

Spikes / Trial

Group I (n = 5)

6 4 2

Vh

0

40 30 20 Vh

10 0

-30

0

2 15 30 Time Points (min)

B.

60

-30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

2 15 30 Time Points (min)

60

2 15 30 Time Points (min)

60

12

60

10

50

Latency (ms)

Spikes / Trial

Group III (n = 4)

8 6 4 Vh

2 0

40 30 20 Vh

10 0

-30

0

C.

2 15 30 Time Points (min)

60

-30

0

10

60

8

50

Latency (ms)

Spikes / Trial

Combined (Group I and III, n = 9)

6 4 2

Vh

0

40 30 20 Vh

10 0

-30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

-30

0

  

 

Figure 3.19 Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA of  the  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  sciatic  nerve‐evoked  responses  of  STT  neurons. Each bar in each graph represents the group mean (± SEM) value. The time point ‐ 30  min  in  each  graph  represents  the  time  at  which  the  baseline  response  was  measured  before microinjections of vehicle control solution (Vh; 1 μL/side). The response magnitudes  (spikes/trial)  and  response  latencies  (ms)  are  represented  in  the  left  right  panels,  respectively.  The  graphs  in  A  and  B  show  results  of  Group  I  and  Group  II  STT  neurons,  respectively. The graphs in C show combined values of Group I and Group III. In all cases, p  > 0.05, paired Student’s t test.     

76 

Results   

B.

Peak height (μV)

A.

0.1 μV

S Peak latency (ms)

2 ms

S 0.1 μV 10 ms

 

  Figure  3.20  Example  of  presynaptic  afferent  volley  recorded  in  the  spinal  cord  evoked  by  stimulation  of  sciatic  nerve.  The  sciatic  nerve  was  stimulated  at  2  times  the  threshold  intensity,  which  was  the  minimum  intensity  required  to  produce  a  single  or  short  train  of  orthodromic  action  potentials.  The  stimulus  (S)  applied  to  the  sciatic  nerve  is  followed  by  afferent  volley  (enclosed  in  the  box),  which  in  turn,  is  followed  by  a  compound  action  potential  (A).  The  trace  shown  in  the  upper  right  (B)  is  time  and  amplitude  expanded  portion of the stimulus and afferent volley.    

      77 

Results 

                    Peak‐Trough Amplitude                                        Latency  Group I (n = 5) 1.4

3.5

1.2

3.0

1.0

2.5

Latency (ms)

Peak Height (μV)

A.

0.8 0.6 0.4 Vh

0.2

2.0 1.5 1.0 Vh

0.5 0.0

0.0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

-30

60

0

2

15

30

60

2 15 30 Time Points (min)

60

Time Points (min)

Group III (n = 4) 3.0

3.0

2.5

2.5 Latency (ms)

Peak Height (μV)

B.

2.0 1.5 1.0 0.5

2.0 1.5 1.0 0.5

Vh

Vh

0.0

0.0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

C.

-30

60

0

3.0

3.0

2.5

2.5 Latency (ms)

Peak Height (μV)

Combined (Groups I and III, n = 9)

2.0 1.5 1.0 0.5

2.0 1.5 1.0 0.5

Vh

Vh

0.0

0.0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

-30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

 

Figure 3.21 Effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  sciatic  nerve‐evoked  afferent  volley  recorded  in  the lumbar spinal cord of the isoflurane‐anesthetized rat preparation. Time relative to zero  is indicated in  minutes. Each  bar  in each graph represents the group mean (± SEM) value.  The time point ‐30 min in each graph represents the time at which the baseline response was  measured before microinjections of vehicle control solution (Vh; 1 μL/side). The peak‐trough  amplitudes  (μV)  and  the  latencies  (ms)  of  afferent  volley  are  shown  in  the  left  and  right  panels,  respectively.  The  graphs  in  A  and  B  show  results  of  Group  I  and  Group  II  STT  neurons, respectively. The graphs in C show combined values of Group I and Group III. In  all cases, p > 0.05, paired Student’s t test.  78 

Results    Group I STT Neurons

 

minutes after vehicle control (1 μL/side) 

Electrophysiological  Parameter 

Baseline

SFR (n = 6)

8.6 ± 2.1 

10 ± 4.6 

8.5 ± 4.2 

8.3 ± 3.43 

10.4 ± 3.6 

FI (n = 6)

82.3 ± 6.1 

74.1 ± 11.3 

74.3 ± 11.3

76.7 ± 8.2 

84.9 ± 6.9 

6 ± 2 

7.3 ± 1.8 

6.8 ± 1.7 

7.1 ± 1.6 

11.5 ± 5.4 

14.8 ± 5.9 

15.7 ± 4.4 

15.7 ± 5.8 

15 ± 4.6 

15.8 ± 10.6 

6.3 ± 2.3 

6.7 ± 2.2 

6.5 ± 2.1 

6.5 ± 2.1 

4.4 ± 1.2 

47.2 ± 2.4 

44.6 ± 0.67 

43.3 ± 1.1 

43.1 ± 1.6 

43.2 ± 1 

Su-ER Magnitude (n = 5) Su-ER Latency (n = 5) Sc-ER Magnitude (n = 5) Sc-ER Latency (n = 5)

2 

microinjections 15  30 

60 

 

Table 3.2 Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into the  MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation on the electrophysiological parameters of  Group I STT neurons. The results are expressed as the group means (± SEM). The neurons in  this  group  were  treated  with  Vh  microinjections  (1  μL/side)  only.  Note  that  none  of  the  parameters  was  significantly  changed  following  Vh  microinjections  (p  >  0.05,  paired  Student’s t test).  Legend:   SFR: spontaneous firing rate (spikes/s)  FI: firing index  Su‐ER magnitude: magnitude of sural nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Su‐ER latency: mean latency of sural nerve‐evoked STT response (ms)  Sc‐ER magnitude: magnitude of sciatic nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Sc‐ER latency: mean latency of sciatic nerve‐evoked STT response (ms) 

79 

Results    Group III STT Neurons

 

minutes after vehicle control (1 μL/side) 

Electrophysiological Parameter 

Baseline

SFR (n = 6)

19 ± 4.7 

15.4 ± 4.8 

14 ± 5.6 

18.1 ± 6 

18.9 ± 5.8 

93.8 ± 2.1 

83.8 ± 6.9 

86.9 ± 6.7 

89.1 ± 5.54 

90.4 ± 4.7 

7.1 ± 1.1 

7.4 ± 2 

6.2 ± 2.2 

6.8 ± 1.9 

7.2 ± 2 

14 ± 2.9 

14.4 ± 2 

14.4 ± 0.4 

13.8 ± 5.5 

13.9 ± 2.1 

8.1 ± 1.2 

8.1 ± 1.9 

6.7 ± 2.3 

5.9 ± 2.1 

6 ± 1.8 

44.5 ± 0.53

43.4 ± 0.9 

43.1 ± 1.9 

41.8 ± 1.8 

42 ± 1.3 

FI (n = 6) Su-ER Magnitude (n = 4) Su-ER Latency (n = 4) Sc-ER Magnitude (n = 4) Sc-ER Latency (n = 4)

2 

microinjections 15  30 

60 

  Table 3.3 Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into the  MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation on the electrophysiological parameters of  Group  III  STT  neurons.  The  results  are  expressed  as  the  group  means  (±  SEM).  The  STT  neurons in this group were treated first with the bilateral microinjections of Vh (1 μL/side)  into  the  MPTA.  After  recovery,  these  same  neurons  were  treated  with  bilateral  microinjections  of  pentobarbital  (200  μg/side)  into  the  MPTA.  This  table  shows  results  obtained  following  the  microinjections  of  Vh.  Note  that  none  of  the  parameters  was  significantly changed following Vh microinjections (p > 0.05, paired Student’s t test).  Legend:   SFR: spontaneous firing rate (spikes/s)  FI: firing index  Su‐ER magnitude: magnitude of sural nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Su‐ER latency: mean latency of sural nerve‐evoked STT response (ms)  Sc‐ER magnitude: magnitude of sciatic nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Sc‐ER latency: mean latency of sciatic nerve‐evoked STT response (ms)     

80 

Results     

Combined results of  Groups I & III STT Neurons minutes after vehicle control (1 μL/side) 

Electrophysiological Parameter 

Baseline

SFR (n = 12)

13.8 ± 2.9 

12.7 ± 3.3 

11.3 ± 3.4 

13.2 ± 3.6 

15.5 ± 4.1 

FI (n = 12)

88 ± 3.5 

78.9 ± 6.1 

81.1 ± 6.3 

82.9 ± 5.1 

89.2 ± 1.2 

Su-ER Magnitude (n = 9) Su-ER Latency (n = 9) Sc-ER Magnitude (n = 9) Sc-ER Latency (n = 9)

6.5 ± 1.2 

7.3 ± 1.2 

6.5 ± 1.4 

7 ± 1.2 

9 ± 2.5 

14.5 ± 3.6 

15.1 ± 3.4 

15.1 ± 3.9 

14.5 ± 3.9 

14.7 ± 5.7 

7.1 ± 1.4 

7.3 ± 1.4 

6.6 ± 1.5 

6.2 ± 1.4 

5.2 ± 1.1 

43.6 ± 2.3 

44.1 ± 3.7 

45.6 ± 3.2 

47.2 ± 3.9 

46.5 ± 3.6 

2 

microinjections 15  30 

60 

 

Table 3.4 Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into the  MPTA  of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  electrophysiological  parameters  obtained by combining the results obtained from Groups I and III STT neurons. The results  are  expressed  as  the  group  means  (±  SEM).  Note  that  none  of  the  parameters  was  significantly changed following Vh microinjections (p > 0.05, paired Student’s t test).  Legend:   SFR: spontaneous firing rate (spikes/s)  FI: firing index  Su‐ER magnitude: magnitude of sural nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Su‐ER latency: mean latency of sural nerve‐evoked STT response (ms)  Sc‐ER magnitude: magnitude of sciatic nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Sc‐ER latency: mean latency of sciatic nerve‐evoked STT response (ms) 

81 

Results 

3.2.3.2. MICROINJECTIONS OF PENTOBARBITAL  

3.2.3.2.1. Spontaneous Firing Rate: Pentobarbital Microinjections 

Figure 3.22 shows the group mean (± SEM) spontaneous firing rate (SFR) of the STT neurons  before  and  at  various  time  points  after  bilateral  microinjections  of  pentobarbital  (PB,  200  μg/side) into the MPTA. 

 

STT neurons in group II (Fig. 3.22A, n = 6) were treated only with PB microinjections. 

The  group  mean  (±  SEM)  baseline  control  SFR  of  Group  II  STT  neurons  before  PB  microinjections  measured  11.8  ±  2.9  spikes/s.  For  these  same  neurons,  the  SFR  were  significantly reduced  to  5.3  ± 1.4 spikes/s  at 2 min  and  to  5.5 ±  1.7  spikes/s at 15 min  after  microinjections of PB (p  0.05, paired Student’s t test). 

These  results  indicate  that  bilateral  microinjections  of  PB  into  the  rat  MPTA  suppressed  the  magnitude  of  Sc‐ER  of  STT  neurons.  The  mean  latency  of  the  evoked 

99 

Results  responses  was  not  altered.  Similarly  the  presynaptic  volley  arising  from  sciatic  nerve  stimulation was not affected by PB microinjections into the MPTA.    

The  results  of  effects  of  microinjections  of  PB  into  the  MPTA  on  the  four  electrophysiological parameters are illustrated in Tables 3.6 through 3.8. 

100 

Results  Response Magnitude                                     Response Latency  A.

Group II (n = 6) 60 Mean Latency (ms)

14 Spikes / Trial

12 10

*

8 6

*

*

4 PB

2 0

0

2 15 30 Time Points (min)

B.

30 20 10

60

PB

-30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

Group III (n = 4)

14 Mean Latency (ms)

60

12 Spikes / Trial

40

0 -30

10 8 6 4 PB

2 0

50 40 30 20 10

PB

0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

C.

60

-30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

Combined (Groups II and III, n = 10)

14 Mean Latency (ms)

60

12 Spikes / Trial

50

10

*

8

*

*

6 4 PB

2 0

50 40 30 20 10

PB

0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

-30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

Figure 3.30 Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of isoflurane‐ anesthetized rat preparation on sciatic nerve‐evoked responses of STT neurons. Each bar in  each graph represents the group mean (± SEM) value. Time relative to zero is indicated in  minutes.  The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  at  which  baseline  responses  were  measured  before  microinjections  of  pentobarbital  (PB;  200 μg/side).  The  response magnitude (spikes/trial) and response latency (ms) are represented in the left and  right panels, respectively. The graphs in A and B represent results of Group II and Group III  STT neurons, respectively. The graphs in C show combined data of Group II and Group III  STT  neurons.  The  asterisks  (*)  indicate  statistically  significant  reduction  in  the  response  magnitude  following  PB  microinjections  compared  to  the  baseline  magnitude.  The  test  statistics (paired Student’s t test) for significant differences is as follows: Group II (baseline‐2  min: t(5) = 3.66, p = 0.02; baseline‐15 min: t(5) = 4.07, p = 0.01; baseline‐30 min: t(5) = 4.89, p =  0.005); combined Groups II and III (baseline‐2 min: t(9) = 3.32, p = 0.009; baseline‐15 min: t(9)  = 3.61, p = 0.006; baseline‐30 min: t(9) = 3.28, p = 0.01).  

101 

Results 

                      Peak‐Trough Amplitude                                     Latency  A.

Group II (n = 6) 5

0.7

4

0.5

Latency (ms)

Peak Height (μV)

0.6

0.4 0.3 0.2

3 2 1

PB

0.1

PB

0

0.0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

-30

60

B.

0

2 15 30 Time Points (min)

60

2 15 30 Time Points (min)

60

1.0

5

0.8

4 Latency (ms)

Peak Height (μV)

Group III (n = 4)

0.6 0.4 0.2

3 2 1

PB

PB

0

0.0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

C.

-30

60

0

Combined (Groups II and III, n = 10) 4

0.6

Latency (ms)

Peak Height (μV)

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1

3 2 1

PB

PB

0.0

0 -30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

-30

0

2 15 30 Time Points (min)

60

 

Figure 3.31 Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of isoflurane‐ anesthetized rat preparation on sciatic nerve‐evoked afferent volley recorded in the lumbar  spinal cord of the isoflurane‐anesthetized rat preparation. Each bar in each graph represents  the group mean (± SEM) value. Time relative to zero is indicated in minutes. The time point  ‐30 min in each graph represents the time at which baseline responses were measured before  microinjections of pentobarbital (PB; 200 μg/side). The peak‐trough amplitude (μV) and the  latency  (ms)  of  afferent  volley  are  shown  in  the  left  and  right  panels,  respectively.  The  graphs in A and B depict results of Group II and Group III STT neurons, respectively. The  graph in C shows combined results of Group II and Group III. For all cases p > 0.05, paired  Student’s t test. 

102 

Results 

 

Group II STT Neurons

Electrophysiological Parameter 

Baseline

SFR (n = 6)

11.8 ± 2.9 

FI (n = 6)

88.9 ± 7.4 

Su-ER Magnitude (n = 6) Su-ER Latency (n = 6) Sc-ER Magnitude (n = 6) Sc-ER Latency (n = 6)

8.8 ± 2.3 

minutes after pentobarbital (200 μg/side)  microinjections 15  30 

2 

16.1 ± 5.2  9.7 ± 2.8  42.3 ± 3.6 

9.7 ± 1.3 

*

5.5 ± 1.9  

*

66.8 ± 14.1  78.5 ± 14.2 

5.3 ± 1.4   49.2 ± 13  

*

60  12.1 ± 3.5  78 ± 12.2 

*

5.8 ± 2.2 

5.9 ± 2.3 

10.2 ± 2.3 

15.7 ± 3.7 

16 ± 4.8 

15.9 ± 6.6 

16.6 ± 4.6 

*

9.6 ± 2.6 

4.9 ± 2.1  

6.3 ± 2.7  

*

5.6 ± 2.4  

*

5.7 ± 2.4  

43.2 ± 5.8 

43.4 ± 4.8 

41.2 ± 6.14 

44.6 ± 5.6 

  Table 3.6 Summary of effects of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of  the isoflurane‐anesthetized rat preparation on the electrophysiological parameters of Group  II STT neurons. The results are expressed as the group means (± SEM). The neurons in this  group  were  treated  with  pentobarbital  microinjections  (200  μg/side)  only.  The  asterisks  (*)  indicate  statistically  significant  reduction  in  the  electrophysiological  parameter  following  pentobarbital  microinjections  compared  to  its  respective  baseline  value  (p