pentru implanturile ortopedice, dar şi în chirurgia maxilo-facială, în implanturile
dentare. Acoperirea implanturilor de titan cu hidroxiapatita de calciu (HA).
Craiova Medicală
Vol 9, Nr 4, 2007
Studiu de farmacie Testarea in vitro a unor structuri de tip implant J. NEAMŢU, P.G. ANOAICA, O. CROITORU, I. VIAŞU-BOLOCAN, L. BEJENARU, MARIANA TĂTUCU Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicină şi Farmacie din Craiova
The testing in vitro of implant - type structures REZUMAT Ceramicile ce au la bază fosfaţii de calciu
ABSTRACT Ceramics which have as base the
sunt foarte des utilizate în aplicaţiile medicale, în special pentru implanturile ortopedice, dar şi în chirurgia maxilo-facială, în implanturile dentare. Acoperirea implanturilor de titan cu hidroxiapatita de calciu (HA) asigură posibilitatea integrării proprietăţilor mecanice ale Ti cu cele ale osteoconductivităţii HA. Testarea biomaterialelor în ceea ce priveste potenţialul lor bioactiv se realizeaza in vitro, prin imersare în soluţii anorganice ce simulează fluidele biologice (SBF). De aceea această lucrare prezintă măsurători FTIR, ale unor structuri de tip implant introduse în soluţii SBF pe durata a trei saptămâni. În acelaşi timp s-a efectuat şi spectroscopie ICP asupra soluţiilor gazdă.
calcium phosphates are usually used in the medical applications, specially for orthopedic implants, maxilofacial surgery or dental implants. The cover of titan implants with calcium hidroxyapatite (HA) assures the possibility of integration for mechanic property of Ti with the ones of HA osteoconductivity. The testing of biomaterials, regarding their bioactive potentially, is achieved in vitro through immersion in inorganic solution which simulate the biologic fluid (SBF). Considering these, the paper presents FTIR measurements of implant type structure immersed in the SBF solutions during three weeks period. In the same time was made the ICP spectroscopy fort host solutions
CUVINTE CHEIE ceramică, implant, biomateriale, bioactivitate
KEY WORDS ceramics, implants, biomaterials, bioactivity
Introducere Evoluţia tehnologică a metodelor de depunere de materiale anorganice a avut un mare impact în domeniul implanturilor medicale cu aplicaţii ortopedice şi dentare. Cerinţele impuse dispozitivelor implantate sunt: netoxicitatea, biocompatibilitatea, bioactivitatea şi rezistenţa la uzura mecanică. Acoperirile implanturilor din Ti cu ceramici ce au la bază fosfatul de calciu asigura posibilitatea integrării proprietăţilor mecanice ale titanului cu proprietăţile osteoconductive ale fosfaţilor de calciu şi îmbunătăţirea legăturii între ţesut şi metalul implantat [1-4]. Succesul unui implant (dentar sau ortopedic) depinde de fixarea sa puternică în ţesutul înconjurător ce-i permite să suporte solicitările mecanice permanente la care este supus. Numeroşi factori, printre care enumeram tehnicile chirurgicale, designul implantului şi topografia suprafeţei sale, sunt cunoscuţi ca factori ce au o influenţă majoră asupra integrarii implantului. Posibilitatea cresterii coeziunii între ţesutul osos şi implant cu ajutorul acoperirii implantului cu un strat de hidroxiapatită (HA) a fost demonstrată pe larg în ultimii ani. De asemenea, tehnicile de depunere clasice pentru acest tip de depunere induc deseori tensiuni reziduale la interfaţa metal/hidroxiapatită, precum şi nonuniformităţi structurale şi o aderenţă slabă, factori ce stau la originea delaminării filmului ceramic.
Această decoeziune se află deseori la originea defuncţionalizării implantului, acesta necesitând a fi extras dupa o anumită perioadă din organism. De aceea, în ultimii ani, s-au intensificat cercetările privind găsirea unor noi metode de depunere a fosfaţilor de calciu pe structuri metalice . Acoperirea implanturilor metalice cu HA se realizează prin diverse metode cum ar fi pulverizare în plasmă [5], depunere chimică şi electrolitică [6], depunere laser pulsată (PLD) [7] sau pulverizare în radiofrecvenţă (RF-MS) [8]. Hidroxiapatita de calciu (HA)– Ca10(PO4)6(OH)2 – este un material care se dezvolta în mod natural în ţesutul osos ; de exemplu, osul uman cortical matur conţine aproximativ 70% HA cristalină în volum. Rezultatele experimentale [9-10] arată că atunci când un astfel de implant (titaniu acoperit cu HA) este introdus intr-un mediu biologic, la suprafaţa sa se formează un strat de hidroxiapatită carbonatată (HCA) sau apatită bilogică cu o compoziţie chimică mai apropiată de cea a osului. De fapt, de acest strat se leagă atât implantul cât şi materialul osos iar punerea lui în evidenţă este o condiţie necesară pentru ca materialul din care este realizat implantul să fie considerat bioactiv. Testarea biomaterialelor în ceea ce priveşte potenţialul lor bioactiv a fost realizată pentru prima oară de Kokubo şi colaboratorii [11], prin
Prof Univ Dr Johnu Neamţu, Disciplina Fizică farmaceutica, Facultatea de Farmacie, UMF Craiova
361
J Neamţu şi colab: Testarea in vitro a unor structuri de tip implant
imersie în soluţii anorganice ce simulează fluidele biologice (SBF). Aceste soluţii au compoziţii şi concentraţii ionice similare cu plasma umană sanguină şi sunt folosite pentru a testa potenţialul bioactiv al materialelor utilizate la realizarea protezelor ortopedice şi stomatologice. Astfel, inducerea in vitro a unui strat HCA la suprafaţa implanturilor, după introducerea lor în SBF este o condiţie necesară pentru ca acestea să se menţină bioactive şi la implantarea in vivo [12]. Scopul studiului experimental raportat în aceasta lucrare este analiza modificărilor fizicochimice ce au loc la suprafaţa unor structuri de tip implant, atunci când sunt introduse în soluţii SBF. Depunerile de HA au fost realizate într-o instalaţie de cercetare pentru depunere de filme subţiri. prin pulverizare în radiofrecvenţă. Detalii privind aceasta tehnica de depunere au fost prezentate anterior acestui studiu [8]. Astfel HA este presată sub forma unui disc, numit ţintă, iar asupra ei se trimite un fascicul de radiofrecventă (1.78MHz) ce determină încălzirea, topirea, vaporizarea şi depunerea HA pe un substrat aflat la 30 mm de ţintă. Procesul se desfăşoară într-o cameră de iradiere în care se găseşte argon la presiunea de 23 mTorr. Rata depunerii prin acest procedeu este de 1 μm/h iar după iradiere depunerile sunt supuse unor tratamente termice la temperatura de 550° C timp de o oră, într-o atmosferă îmbogăţită cu vapori de apă. Analizele de difracţie XRD efectuate după aceste tratamente arată că prin acest procedeu se obţin straturi de HA cristaline . Folosind această metodă au fost raportate depuneri de HA pe substrat de Ti-5Al-2.5Fe, staturile depuse fiind aderente şi uniforme . Pentru a evita fenomenele de oxidare şi de difuzie a atomilor de titan către interfaţa HA - soluţie SBF am utilizat substraţi monocristalini de siliciu de tip (100). Modificările fizico - chimice ce au loc la suprafaţa structurilor au fost analizate prin spectroscopie cu transformată Fourier în infraroşu (FTIR). Procesele ce au loc în soluţiile fiziologice au fost urmărite prin spectroscopie ICP.
Material şi metodă Investigaţiile in vitro ale structurilor de tip implant au loc atât în culturi de celule, în care se urmăreşte răspunsul biologic al celulelor, dar şi în soluţii ionice ale căror concentraţii sunt similare fluidelor biologice. În aceste soluţii se urmăresc de fapt modificările fizico-chimice ale implantului datorită interacţiunii acestuia cu fluidele din zona de implantare. Soluţiile SBF, ale căror concentraţii ionice sunt aproximativ egale cu cele ale plasmei umane – vezi Tabelul 1 – au fost preparate prin dizolvarea
362
în apă distilată a următorilor reactivi: NaCl, NaHCO3, KCl, K2PO4 3H2O, CaCl2, Na2SO4. Ele au fost stabilizate la un pH = 7,4 cu HCl (1M) şi trihidroximetil aminometan (CH2OH)3CNH2 [13]. Tabelul 1 Concentraţiile ionice (mM) ale plasmei sanguine şi ale soluţiei SBF
Ion SBF Plasmă Na+ 142.0 142.0 K+ 5.0 5.0 2+ Mg 1.5 1.5 Ca2+ 2.5 2.5 Cl– 147.8 103.0 HCO3– 4.2 27.0 2– HPO4 1.0 1.0 SO42– 0.5 0.5 Depunerile obţinute prin RF-MS au fost introduse în soluţii şi menţinute pe o perioadă de trei săptămâni la temperatura de 37°C. La intervale de 48 de ore probele au fost analizate prin spectrofotometrie de transmisie în IR. În acelaşi timp prin spectroscopie ICP s-au urmărit şi concentraţiile ionilor de calciu şi fosfor din soluţie. Analiza spectrofotometrică în infraroşu este o metodă rapidă şi eficientă în caracterizarea fizicochimică a suprafeţei acestor structuri. Chiar dacă acest compus HA nu are benzi foarte intense, prin utilizarea unui spectrofotometru cu transformată Fourier pot fi puse în evidenţă modificările frecvenţelor de vibraţie ce pot apare prin introducerea probelor în SBF. În felul acesta analiza FTIR a suprafeţei probelor este o metodă foarte eficientă în detectarea formării apatitei biologice la suprafaţa implantului. Prin folosirea unei probe din siliciu, identice cu substratul folosit la realizarea depunerilor, s-a încercat eliminarea din spectrul înregistrat a benzilor de absorbţie caracteristice substratului.
Rezultate şi discuţii Într-o primă etapă s-a efectuat analiza FTIR a pulberii de HA folosită la realizarea depunerilor. Spectrul acesta este prezentat în Figura 1. El a fost înregistrat cu un aparat Nicolet Avatar la o rezoluţie de 4cm-1. Pentru obţinerea unui raport semnal / zgomot cat mai bun au fost înregistrate 32 de spectre, pe întreg domeniul spectral al aparatului: 4000 ÷ 400cm-1. Din Figura 1 se observa ca spectrul FTIR al pulberii conţine toate benzile caracteristice modurilor de vibraţie ale grupării fosfat [14]. Acestea sunt: -banda vizibilă la 1090 cm-1 – ce este caracteristică modului de vibraţie υ3, întindere
Craiova Medicală
Vol 9, Nr4 , 2007
asimetrică. Intensitatea acestei benzi este, în acest caz, relativ moderată. Acelaşi mod de vibraţie este caracteristic şi benzii intense de la 1041 cm-1. Prezenţa ambelor benzi este caracteristică fazei cristaline HA. -banda de mică intensitate vizibilă la 960 cm-1 ce prezintă şi un umăr la 950 cm-1. Acestea sunt caracteristice modului de vibraţie υ1 – întindere simetrică. -două benzi situate la 596 cm-1 respectiv 568 -1 cm , caracteristice modului de vibraţie υ4 – deformare asimetrică. 68 66 64 628
62
596
60
960
56
950
%T
58
detectează un zgomot interferenţial în regiunea 1400-2000 cm-1 datorat reflexiilor multiple în lama de Si. Ele nu influenţează însă benzile de interes ale HA. După aceste analize iniţiale, straturile de tip implant au fost introduse în soluţiile fiziologice şi menţinute pe durata a 3 săptămâni la o temperatură de 37°C. La intervale de 24 de ore aceste probe au fost scoase din soluţii, curăţate în alcool şi apă deionizată, uscate şi apoi analizate din nou prin spectroscopie FTIR. Astfel după aproximativ 48 de ore, analiza spectrală FTIR a pus în evidenţă apariţia unei benzi de slaba intensitate centrată pe 877 cm-1, ce aparţine unui mod de vibraţie a grupării carbonat Figura 2 b. Această bandă creşte în intensitate pe durata menţinerii acestor probe în SBF, Figura 3, ceea ce înseamnă că aceste structuri sunt bioactive. 6
54 52
46 44 4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
Wavenumbers (cm-1)
Spectrul mai conţine şi o bandă situată la 628 cm-1 ce este caracteristică modului de vibraţie al grupării hidroxil. 120 110 100
%T
90
958 1084
a
628
70
571 599
60 1031
50
628 100
80 %T
877 b
60
1084 958
40
20 4000
571 599
1031 3500
3000
2500
2000
4
3
2
Fig. 1: Spectrul pulberii HA din care s-au realizat ţintele
80
aria relativa
1041
48
568
1090
5
50
1500
1000
500
cm-1
Fig. 2: Spectrul FTIR al probelor depuse prin RFMS înainte (a) şi după (b) menţinerea pe durata a 3 săptămâni în SBF
Pentru a pune în evidenţă modificările ce au loc la suprafaţa depunerilor de HA, introduse în soluţiile fiziologice, spectrele IR ale acestor structuri au fost înregistrate înainte şi după introducerea în soluţiile SBF, Figura 2 a, b. În spectru Figura 2.a se observă toate modurile de vibraţie ale grupării fosfat. Benzile sunt ascuţite, despicate ceea ce arată că depunerile sunt cristaline. În plus aceste depuneri nu sunt contaminate cu impurităţi. De asemenea se
1 2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
timp , zile
Fig.3: Variaţia în timp a ariei relative A/Ainitiala a benzii de la 877cm-1
De asemenea are loc şi o modificare a benzilor de absorbţie ale grupării fosfat. Astfel aria acestor benzi creşte de aproximativ trei ori după menţinerea în SBF. Acest aspect împreună cu modificarea morfologiei suprafeţei, pusă în evidenţă prin microscopie electronică (SEM) [15] demonstrează că are loc un proces de creştere chimică a unei noi structuri. Analiza spectrofotometrică arată că această structură este de fapt HCA. Pentru a elucida mecanismul formării acestei structurii am urmarit prin spectroscopie ICP variaţiile în timp ale concentraţiilor ionilor de calciu şi fosfor din soluţiile gazdă. Aşa cum se observă în primele 48 de ore valorile acestora cresc, Figura 4, ca urmare a existenţei unui proces de dizolvare al filmului de HA. Acest proces va determina o suprasaturare la interfaţa soluţie - HA. Ulterior ionii de calciu şi fosfor din soluţie sunt adsorbiţi la suprafaţa filmului, proces ce va sta la baza depunerii unei noi faze de HA pe suprafaţa structurii iniţiale. Acest aspect este pus in evidenta prin scăderea în timp a concentraţiilor ionilor de Ca si P din soluţie, Figura 4. 363
J Neamţu şi colab: Testarea in vitro a unor structuri de tip implant
Menţionam că principalele canale ce stau la baza acestei depuneri chimice sunt: HPO42- ' PO43- + H+ (1) H+ + HCO33- ' H2O + CO2 (2) 10Ca2+ + 6PO43- + 2HO- → Ca10(PO4)6(OH)2 (3) sau Ca2+ + HPO42- + 2 HO- → CaHPO4 · 2H2O (4) Astfel, primele două reacţii nu modifica pH-ul soluţiei, protonii rezultaţi din descompunerea HPO42-fiind consumaţi în reacţia de oxidare a ionului HCO33- în timp ce ultimele reacţii stau la baza creşterii chimice a unei noi faze de HA. 7
P
1.0
6
0.8
4
Ca
0.6
3
P, mM
Ca, mM
5
0.4 2 0.2
1 0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0.0 20
zile
Fig.4. Variaţia în timp a concentraţiei ionilor de fosfor şi calciu din soluţiile SBF
Ulterior ionii de carbonat din soluţie pot ocupa poziţiile ionilor hidroxil şi fosfat din noua structură HA ducând în final la obţinerea unui compus chimic ce poate fi reprezentat prin formula generală: Ca10-x(PO4)6-x(CO3)x(OH)2-x nH2O
Concluzii Rezultatele experimentale ale acestui studiu arată că depunerile de HA prin pulverizare în radiofrecvenţa sunt cristaline şi necontaminate cu impurităţi. Prin imersie în fluid biologic simulat (SBF), depunerile nu sunt biodegradate iar după aproximativ două zile începe un proces de carbonatare ce duce la apariţia apatitei biologice. De aceea se poate spune că structurile astfel obţinute sunt şi bioactive, ele având astfel
performanţe corespunzătoare utilizării acoperirile implanturilor metalice .
Bibliografie 1. Hench LL, Wilson J - (1993), editors, An introduction to bioceramics, vol 1. Singapore: World Scientific. 2. Geesink RGT, de Groot K, Klein CPAT - (1987) Chemical implant fixation using hydroxyl-apatite coatings, Clin. Orthop., 225:147-170. 3. Cooper SL, Peppas NA - (1982) editors, Biomaterials: Interfacial Phenomena and Applications, volume 199 of Advances in Chemistry Series, American Chemical Society. 4. Legeros RZ - (1991) Calcium Phosphates in Oral Biology and Medicine, volume 15 of Monographs in Oral Science, Karger, Basel, Switzerland. 5. Ferraz MP, Monteiro FJ, Serro AP, Saramago B, Gibson IR, Santos JD - (2001) Biomaterials, 22:3105. 6. Ban S, Hasegawa J - (2002) Biomaterials, 23:2965. 7. Nelea V, Ristoscu C, Chiriţescu C, Ghica C, Mihailescu IN, Coenet A - (2000) Appl.Surf.Sci., 168:127. 8. Nelea V, Morosanu C, Iliescu M, Mihailescu IN (2003) Microstructure and mechanical properties of hydroxyapatite thin films grown by RF magnetron sputtering, Surf. Coat. Technol., 173:315-322. 9. Hata K, Kokubo T - (1995) Growth of a bonelike apatite layer on a substrate by a biomimetic process, J. Am. Ceram. Soc., 78:1049-1053. 10. Ducheyne P, Qiu Q - (1999) Bioactive ceramics: the effect of surface reactivity on bone formation and bone cell function, Biomaterials, 20:2287–2303. 11. Kokubo T, Kushitani H, Sakka S, Kitsugi T, Yamamuro T - (1990) Solution able to reproduce in vivo surface-structure changes in bioactive glassceramic A-W, J. Biomed. Mat. Res., 24:721-734. 12. Kokubo T, Ito S, Huang ZT, Hayashi T, Sakka S, Kitsugi T, Yamamuro T - (1990) Ca, P-rich layer formed on high-strength bioactive glass-ceramic AW, J. Biomed. Mat. Res., 24:331-343. 13. Hench L, Wilson J - (1999) An introduction to bioceramics, World Scientific Publishing Co., Pte. Ltd. 14. Elliot JC - (1994) Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium Orthophosphates, volume 18 of Studies in Inorganic Chemistry., Elsevier Science B.V. 15. J. Neamtu, G.E. Stan, C. Morosanu, C. Ducu, I. N. Mihailescu “Chemical growth of calcium phosphate layers in simulated body fluid ” trimisa pentru publicare la Journal of Material Science :Materials in Medicine ;
Adresa pentru corespondenţă Prof. Univ. Dr. Johny Neamţu, Disciplina Fizică farmaceutică, Facultatea de Farmacie, UMF Craiova, , B-dul 1 Mai, Nr.66, 200638,
[email protected]
364
în
