UJI PENDAHULUAN AKTIVITAS SITOTOKSIK DAN ANTIOKSIDAN ...

UJI PENDAHULUAN AKTIVITAS SITOTOKSIK DAN ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL DAUN SIRSAK (Annona muricata Linn.) dan BATANG BROTOWALI (Tinospora crispa) ____________________________________________________________________ Risma Marisi Tambunan, Yesi Desmiaty, Kunthi Wida K.K. Fakultas Farmasi Universitas Pancasila email: [email protected] ABSTRAK Daun sirsak dan batang brotowali secara empirik telah digunakan sebagai obat tradisional berkhasiat antidiabetes. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan karakterisasi farmakognosi dan uji pendahuluan adanya aktivitas antioksidan dan sitotoksik kedua simplisia. Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi kinetik menggunakan pelarut etanol 70% untuk daun sirsak dan etanol 96% untuk batang brotowali. Selanjutnya dilakukan uji penangkap radikal bebas DPPH dan uji aktivitas biologi in vitro secara BSLT. Hasil pemeriksaan parameter farmakognosi daun sirsak dan batang brotowali berturut-turut diperoleh kadar abu total 5,65% dan 4,33%; kadar abu tidak larut asam 1,27% dan 0,31%; kadar abu larut air 0,17% dan 2,77%; kadar sari larut air 23,12% dan 15,65%; kadar sari larut etanol 17,62% dan 6,68%; susut pengeringan 8,05% dan 8,97%. Hasil penapisan fitokimia terhadap daun sirsak menunjukkan adanya golongan alkaloid, flavonoid, saponin, tannin galat, kuinon, steroid, minyak atsiri dan kumarin. Hasil penapisan fitokimia terhadap batang brotowali menunjukkan adanya alkaloid, flavonoid, saponin, steroid/triterpenoid, dan kumarin. Hasil uji BSLT daun sirsak dan batang brotowali berturut-turut diperoleh nilai LC50 20,12 bpj dan 119,2267 bpj. Uji penangkap radikal bebas DPPH berturut-turut diperoleh nilai IC50 22,25 bpj dan 46,4463 bpj. Dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun sirsak dan batang brotowali potensial bersifat antioksidan dan sitotoksik. Keyword : daun sirsak, batang brotowali, sitotoksik, antioksidan, BSLT, DPPH Pendahuluan Obat tradisional yang dikenal berkhasiat antidiabetes sudah banyak yang diteliti secara praklinis. Studi pustaka menunjukkan bahwa daun Anonna muricata (sirsak) memiliki aktivitas antioksidan lebih kuat dibandingkan dengan A. squamosa dan A. reticulata. (Baskar., Indian J Exp Biol). Daun sirsak juga memiliki efek pada jaringan pankreas dengan cara meningkatkan lipid peroksidase dan secara tak langsung meningkatkan produksi antioksidan endogen (Afr. J. Biomed. Res. 9: 173 – 180). Telah ditemukan beberapa asetogenin yang bersifat sitotoksik dari biji sirsak (J Nat Prod. 2002

Apr;65(4):470-5.).

Seminar Nasional POKJANAS TOI XLII- 2012

Page 1

Batang brotowali (Tinospora crispa (L.) Miers, Menispermaceae) merupakan simplisia yang telah dikenal memiliki banyak khasiat salah satunya adalah sebagai antidiabetes, serta telah diuji klinis memiliki efek hipoglikemik dengan dosis 250 mg (J Health Res, 23(3): 125-133) dan antidiabetes pada tikus percobaan (Journal of Ethnopharmacology, 27(1-2): 149-161). Kedua simplisia ini memiliki potensi untuk menjadi obat herbal terstandar, maka untuk mendapatkan adanya potensi aktivitas lain dari kedua simplisia ini, maka dilakukan penelitian aktivitas antioksidan dan sitotoksisitasnya. Alat dan bahan Alat : Alat-alat gelas yang biasa dipergunakan di laboratorium, cawan penguap, krus silikat, penangas air, timbangan analitik (Sartorius BL 210 S), botol semprot, termometer, cawan penguap, krus silikat, desikator, tanur (Nabertherm-Germany), oven (Memmert), stopwatch, spektrofotometer (Shimadzu UV-Visible Spektrophotometer 1601). Bahan : Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirsak (Annona muricata Linn.) dan batang brotowali (Tinospora crispa ) yang diperoleh dari Badan Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (BALITRO), Bogor, Jawa Barat, pereaksi penapisan fitokimia, DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) (e-Merck), garam laut, telur Artemia salina

Metodologi Penelitian Terhadap simplisia dilakukan penetapan parameter farmakognosi meliputi penetapan kadar abu, penetapan kadar abu tidak larut asam, penetapan kadar abu yang larut dalam air, penetapan kadar sari larut air, penetapan kadar abu larut etanol, penetapan susut pengeringan, dan penetapan kadar air (Depkes, 1977; WHO, 1998). Selanjutnya dilakukan penapisan fitokimia meliputi pemeriksaan alkaloid, flavonoid, tanin,

polifenolat,

saponin,

kuinon,

monoterpenoid/seskuiterpenoid

dan

steroid/triterpenoid.


Page 2

Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara ekstraksi dingin yaitu secara maserasi kinetik menggunakan pelarut etanol 70% untuk daun sirsak dan etanol 96% untuk batang brotowali. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan rotavapor dan dikentalkan di atas penangas air serta dihitung DER-native dan rendemen. I. Uji aktivitas biologi dan toksisitas dengan metode BSLT 1. Persiapan larva udang Artemia salina Leach. Bejana penetasan disekat menjadi 2 bagian, yaitu bagian yang terbuka dan bagian yang tertutup, kemudian sebanyak 20 mg telur Artemia salina Leach dimasukkan ke dalam bejana tersebut yang sebelumnya telah diberi air laut sintetik dan disinari dengan lampu TL 18 watt. Setelah 24 jam, telur telah menetas menjadi nauplii, kemudian dipindahkan ke tempat lain. 24 jam setelah itu, nauplii tersebut sudah dapat digunakan sebagai hewan uji. 2. Persiapan larutan uji. Larutan uji dibuat dengan konsentrasi 1000 bpj, 100 bpj, dan 10 bpj ekstrak kental dalam etanol, dan masing-masing dibuat tiga kali pengulangan serta tiga vial yang digunakan sebagai kontrol. 3. Uji BSLT Larutan induk tersebut diatas dipipet sebanyak 500, 50 dan 5 µL berturut-turut, kemudian dimasukkan ke dalam vial, lalu diuapkan hingga kering. Masing-masing konsentrasi dibuat tiga kali pengulangan, kemudian ke dalam masing-masing vial dimasukkan air laut sintetik + 3 ml dan 10 ekor nauplii, lalu ditambahkan air laut sintetik ad sampai 5 mL. Jika sampel sukar larut dalam air laut, tambahkan dimetil sulfoksida (DMSO) 1%. Dihitung tingkat kematian atau mortalitas dengan membandingkan antara jumlah larva yang mati dengan jumlah total larva. Dibuat grafik


Page 3

antara log konsentrasi (sumbu x) terhadap % mortalitas (sumbu y). Nilai LC50 diperoleh dengan cara menarik garis pada nilai 50% dari sumbu y sampai memotong sumbu grafik, perpotongan garis ditarik ke sumbu x. Suatu zat dikatakan aktif atau toksik bila nilai LC50 < 1000 µg/ml. II. Uji aktivitas antioksidan dengan metode penangkap radikal bebas DPPH 1. Pembuatan larutan DPPH (0,4 mM) Ditimbang lebih kurang 15,8 mg DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil), kemudian dilarutkan dengan metanol pro analisis hingga 100,0 mL, tempatkan dalam botol gelap. 2. Pembuatan larutan blanko Dipipet 1 mL larutan DPPH (0,4 mM) ke dalam labu tentukur 5,0 mL, kemudian ditambahkan metanol hingga tanda, lalu homogenkan. 3. Pembuatan larutan uji Timbang 5,0 mg sampel kemudian dilarutkan dalam 5,0 mL metanol pro analisis (1000 bpj), larutan ini merupakan larutan induk. Dipipet 25,0 µL, 50,0 µL, 125,0 µL, 250,0 µL dan 500,0 µL larutan induk (triplo) ke dalam labu tentukur 5,0 mL untuk mendapatkan konsentrasi sampel 5, 10, 25, 50 dan 100 µg/mL. Ke dalam masing-masing labu tentukur ditambahkan 1,0 mL larutan DPPH dan ditambahkan dengan metanol pro analisis sampai tanda, kemudian dihomogenkan. 4. Pembuatan larutan vitamin C sebagai kontrol positif Timbang 5,0 mg vitamin C kemudian dilarutkan dalam 5,0 mL metanol pro analisis (1000 bpj), larutan ini merupakan larutan induk. Dipipet 20,0 µL, 30,0 µL, 40,0 µL, 50,0 µL dan 60,0 µL larutan induk (triplo) ke dalam labu tentukur 5,0 mL untuk mendapatkan konsentrasi sampel 4, 6, 8, 10 dan 12 µg/mL. Ke dalam masing-masing


Page 4

labu tentukur ditambahkan 1,0 mL larutan DPPH dan ditambahkan dengan metanol pro analisis sampai tanda, kemudian dihomogenkan. 5. Uji aktivitas antioksidan Larutan uji dan kontrol positif dengan beberapa konsentrasi diinkubasi pada suhu 37oC selama tepat 30 menit, serapan diukur pada panjang gelombang maksimum 517 nm menggunakan spektrofotometri ultraviolet-cahaya tampak. 6. Cara perhitungan Persentase inhibisi dihitung menggunakan rumus sebagai berikut : % hambatan = (Serapan blanko – Serapan sampel) x 100 % Serapan blanko Perhitungan nilai IC50 dengan memasukkan nilai dari konsentrasi larutan uji (sumbu x) dan persen hambatan terhadap DPPH (sumbu y) kedalam persamaan garis regresi. Semakin rendah nilai IC50 berarti semakin tinggi aktivitas antioksidan sebagai peredam radikal bebas. Aktivitas suatu senyawa dikatakan memiliki aktivitas tinggi jika mempunyai nilai IC50 dibawah 20 bpj, aktivitas sedang jika mempunyai nilai IC50 21100 bpj, aktivitas rendah jika mempunyai nilai IC50 101-200 bpj dan tidak aktif jika mempunyai nilai IC50 diatas 200 bpj.

Hasil Penelitian dan Pembahasan 1. Parameter farmakognosi Dari pemeriksaan parameter farmakognosi terhadap serbuk simplisia daun sirsak dan batang brotowali dengan metoda Materia Medika Indonesia (MMI) hasil dapat dilihat pada Tabel 1, memenuhi persyaratan


Page 5

Tabel 1. Hasil parameter farmakognosi simplisia daun sirsak dan batang brotowali Parameter

Kadar (%)

No farmakognosi 1.

Kadar abu total

2.

Kadar abu tidak larut dalam asam

3.

Kadar abu larut dalam air

4.

Kadar sari larut dalam air

5.

Kadar sari larut dalam etanol

6.

Susut pengeringan

brotowali 4,33 0,31 2,77 15,65 6,68 8,97

sirsak 5,6508 1,2710 0,1663 23,1178 17,6202 8,0505

2. Penapisan fitokimia Tabel 2. Hasil penapisan fitokimia simplisia daun sirsak dan batang brotowali Golongan senyawa

Daun Sirsak

Batang brotowali

Alkaloid

+

+

Flavonoid

+

+

Saponin

+

+

-

-

+

+

Kuinon

+

-

Steroid / triterpenoid

+

+

Minyak atsiri

+

-

Kumarin

+

+

Tanin : Katekuat Galat

Hasil penapisan fitokimia menunjukkan daun sirsak mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, kuinon, steroid, minyak atsiri dan kumarin, sementara batang brotowali mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, steroid dan kumarin. Dari pemeriksaan ini diketahui kandungan senyawa metabolit sekunder yang diduga berperan dalam aktivitasnya.


Page 6

3. Uji aktivitas biologi dengan metode BSLT Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% daun sirsak mempunyai aktivitas biologi dengan LC50 20,12 bpj dan ekstrak etanol batang brotowali LC50 119,2267 bpj. Berdasarkan literatur suatu sampel dikatakan memperlihatkan toksisitas terhadap larva udang bila mempunyai LC50 < 1000 µg/mL, sedangkan bila mempunyai LC50 < 30 µg/mL bersifat sebagai sitotoksik.

Gambar 1. Grafik hasil uji BSLT ekstrak daun sirsak

Gambar 2. Grafik hasil uji BSLT ekstrak batang brotowali

4. Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% daun sirsak (Annona muricata Linn.) memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 yaitu 22,25 bpj dan ekstrak etanol batang brotowali IC50 yaitu 46,4463 bpj, serta vitamin C sebagai


Page 7

pembanding menunjukkan harga IC50 7,0671 bpj. Dari hasil penelitian yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol 70% daun sirsak dan ekstrak etanol batang brotowali memiliki aktivitas antioksidan dengan kekuatan sedang (IC50 21-100 bpj).

Gambar 3. Grafik hasil uji antioksidan vitamin C

Gambar 4. Grafik hasil uji antioksidan ekstrak daun sirsak

Gambar 5. Grafik hasil uji antioksidan ekstrak batang brotowali


Page 8

KESIMPULAN Hasil uji BSLT daun sirsak dan batang brotowali berturut-turut diperoleh nilai LC50 20,12 bpj dan 119,2267 bpj. Uji penangkap radikal bebas DPPH berturut-turut diperoleh nilai IC50 22,25 bpj dan 46,4463 bpj. Dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun sirsak dan batang brotowali potensial bersifat antioksidan dan sitotoksik. Pustaka 1. Baskar R, Rajeswari V, Kumar TS., In vitro antioxidant studies in leaves of Annona species, Indian J Exp Biol. 2007 May;45(5):480-5. 2. Adewole, Stephen O., Martins, Ezekiel A. Caxton-, Morphological Changes and Hypoglycemic Effects of Annona Muricata Linn. (Annonaceae) Leaf Aqueous Extract on Pancreatic Β-Cells of Streptozotocin-Treated Diabetic Rats, African Journal of Biomedical Research, Vol. 9 (2006); 173 - 187 3. Liaw CC, Chang FR., New cytotoxic monotetrahydrofuran annonaceous acetogenins from Annona muricata. J Nat Prod. 2002 Apr;65(4):470-5. 4. Direktorat Jenderal POM., Departemen Kesehatan Republik Indonesia., Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Jakarta, 1989, 137. 5. Chutima Sriyapai, 2009, Hypoglycemic Effect Of Tinospora Crispa Dry Powder In Outpatients With Metabolic Syndrome At King Chulalongkorn Memorial Hospital, J Health Res, 23(3): 125-133. 6. Hamdan Noora and Stephen J.H. Ashcrofta,1989, Antidiabetic effects of Tinospora crispa in rats, Journal of Ethnopharmacology, 27(1-2): 149-161.


Page 9