Supplementary Information for - PNAS

0 downloads 0 Views 2MB Size Report
Supplementary Information for. Rapid ..... Vendor name, catalog number, and available RRID info were listed. Antibodies ..... Nature 340(6233):474–476. 55.
Supplementary Information for Rapid,  Experience-­Dependent  Translation  of  Neurogranin  Enables  Memory   Encoding   Kendrick  J.  Jonesa,  Sebastian  Templeta,b,  Khaled  Zemouraa,  Bozena  Kuzniewskaf,   Franciso  X.  Penaa,b,  Hongik  Hwanga,c,1,  Ding  J.  Leia,d,  Henny  Haensgena,  Shannon   Nguyene,  Christopher  Saenza,b,  Michael  Lewise,  Magdalena  Dziembowskaf  and  Weifeng   Xua,b,2   a

Picower  Institute  for  Learning  and  Memory,  bDepartment  of  Brain  and  Cognitive  

Sciences,  cDepartment  of  Chemistry,  dDepartment  of  Biology,  Massachusetts  Institute  of   Technology,  77  Massachusetts  Ave.,  Cambridge,  MA  02139,  USA,  eStanley  Center  for   Psychiatric  Research,  Broad  Institute  of  Harvard  and  MIT,  7  Cambridge  Center,   Cambridge,  MA  02142,  USA,  fCentre  of  New  Technologies,  University  of  Warsaw,  S.   Banacha  2c,  02-­097  Warsaw,  Poland     Weifeng  Xu   Email:    [email protected]  

1 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1716750115

This PDF file includes: Supplementary text Figs. S1 to S6 Tables S1 to S2 References for SI reference citations Other supplementary materials for this manuscript include the following: Datasets S1

2

SI  Materials  and  Methods     Commercially  Available  Resources     Supplemental  Index,  Table  S2     Animals   All  animals  were  maintained  in  a  vivarium  with  a  light/dark  cycle  (7:00  a.m.-­7:00  p.m.).   Animal  care  and  handling  were  performed  according  to  NIH  guidelines  and  with  the   approval  of  the  Massachusetts  Institute  of  Technology  (MIT)  institutional  animal  care  and   use  committee  (IACUC)  and  Division  of  Comparative  Medicine  (DCM).   AAV  Expression  Constructs     The 1.3 kB CaMK promoter was subcloned from pLenti-CaMKIIa-hChR2-EYFP-WPRE (64) in an adeno-associated viral vectors (AAV) with AAV2 ITRs (65). The  Ng  3’-­UTR,   Gapdh  3’-­UTR  and  truncation  Ng  389-­577  were  PCR  amplified  and  cloned  into  an  GFP-­ expressing  AAV  vector  under  the  control  of  the  CaMK  promoter.  Neurogranin  cDNA  was   PCR  amplified  from  the  human  neurogranin  cDNA  from  ATCC  (MGC-­3856),  and  Ng  and   NgΔIQ  deletion  construct  were  cloned  into  an  AAV  expression  vector  under  the  CaMK   promoter  in  frame  with  eGFP.    Detailed  primer  sequence  and  cloning  strategy  in   supplemental  methods.  Target  sequences  for  Luciferase  (CGTACGCGGAATACTTCGA)   and  for  Fmr1  (66)  (GTGATGAAGTTGAGGTTTA)  were  used  for  generating  AAV  vectors   of  shLuc  and  shFmr1  under  the  H1  promoter(65,  67).  The  same  CaMKpromoter-­Ng-­ eGFP  cassette  from  above  was  used  to  generated  the  rescue  AAV  constrcuts  shLuc-­Ng-­ eGFP  and  shFmr1-­Ng-­eGFP.        

3

Viral  Production     AAV  2/9  serotype  AAV  vectors  were  produced  as  previously  described  (67-­69).     Viral  Injection   Male  C57BL/6Ncrl  mice  were  prepared  for  surgery  using  standard  procedures (67)  in   accordance  with  NIH  guidelines  and  with  the  approval  of  the  MIT  IACUC  and  DCM.  The   coordinates  for  the  dentate  gyrus  are  anterior-­posterior  (AP),  −2.2  mm;;  medial-­lateral   (ML),  ±1.2  mm  from  bregma;;  dorsal-­ventral  (DV),  −1.6  mm  below  the  dura.     Drugs   Anisomycin  (150  mg/kg  IP)  was  dissolved  in  0.1  M  HCl  and  pH  adjusted  with  phosphate   buffered  saline  and  injected  at  10  ml/kg.  Bicuculline  methobromide  was  dissolved  in   ddH2O  at  40  mM  and  used  at  40  µM.  Actinomycin  D  was  dissolved  in  ddH2O  at  5mM   and  used  at  5  µM.  Cycloheximide  was  dissolved  in  methanol  at  100  mM  (for  cell  culture   experiments)  and  used  at  100  µM  or  100  mg/ml  and  used  at  100  µg/ml  (for   polyribosomes).       Behavioral  Analysis   Context  memory  test  with  pre-­exposure (70):  C57BL/6Ncrl  7-­9  weeks-­old  male  mice   were  habituated  to  the  room  for  4  hours,  48  and  24  hours  prior  to  experiments.  19  cm   x19  cm  with  16  stainless  steel  rods  as  a  floor  (Coulbourn  Instrumnents)  were  used  as   the  context.    The  chamber  was  cleaned  with  Quatricide  before  and  between  each   subject.  The  chamber  had  a  light  ethanol  scent.  Animals  were  exposed  to  the  context  for   the  indicated  time.  24  hours  later,  animals  were  placed  in  the  chamber,  given  an   immediate  shock  (0.7  mA,  2  sec)  through  the  floor  rods  with  a  shock  generator   (Coulbourn  Instrumnents)  and  removed  from  the  chamber  after  a  total  of  1  minute.    30  

4

minutes  later,  animals  were  re-­exposed  to  the  chamber  for  3  minutes  to  assay  freezing.     At  least  two  cohorts  of  the  animals  in  each  experiment  were  blinded  to  the  experimenter.   Animal  IDs  were  blinded  for  data  analyses.  The  Fmr1  KO  mouse  line  was  backcrossed   >10  generations  with  C57BL/6Ncrl.  7-­9  week  old  knockout  and  wild  type  littermates  were   tested  in  the  same  manner  as  above.   Novel  Context  Exposure:  Animals  were  individually  housed  72  hours  prior  to  the   experiment.  48  and  24  hours  prior  to  experiment  animals  were  habituated  to  the  room  for   4  hours.    The  novel  context  was  either  the  contextual  fear  conditioning  chamber   described  above  or  a  40.6  x  40.6  x  30.5  cm  plexiglass  chamber.  Animals  were  allowed   to  explore  the  chamber  for  8  minutes  and  returned  to  the  home  cage  for  7  minutes.   Open  Field:  Locomotion  and  center  crossings  were  measured  in  open  field  chambers   (41.9  x  40.6  x  30.5  cm;;  AccuScan  Instruments).  Activity  was  detected  by  infrared  beam   breaks  and  recorded  automatically  by  VersaMax  software  (AccuScan  Instruments).   Distance  traveled  (cm)  data  were  automatically  binned  in  5-­minute  intervals  and  total   distance  traveled.   Elevated  Plus  Maze:  Mice  were  tested  on  a  4  arm  elevated  plus  maze.    Closed  arms   were  25  x  5  x  5  and  open  arms  were  25  x  5  x  0  cm.  Animals  were  placed  in  the  center  of   the  maze  and  allowed  to  explore  for  5  min.  Time  spent  in  each  arm  and  number  of   entries  into  the  open  arms  were  quantified  using  Ethovision  (Noldus)  software.   Polyribosome  Enrichment  and  Real  Time  RT-­PCR   Mice  were  rapidly  decapitated  and  submerged  in  liquid  nitrogen  for  4  seconds  to  rapidly   cool  brain  tissue.  Hippocampi  were  dissected  on  ice  within  90  seconds,  and   homogenized,  and  polyribosome  enrichment  was  performed  as  described  (Fig.  2B)  (71,   72).    

5

RNA  was  quantified  with  a  NanoDrop  and  reverse  transcribed  using  Superscript  VILO   (Invitrogen)  using  25  –  50  ng  of  RNA.  Samples  with  yield  less  than  100  ng  RNA  or   produced  260/280  absorbance  ratios  less  than  1.8  were  discarded  from  future  analyses.   Real  time  PCR  was  performed  using  Ssofast  Evagreen  supermix  (BioRad)  on  a  C1000   thermal  cycler  with  the  CFX96  detection  system  (BioRad).  Fold  change  for  each   experimental  cDNA  was  normalized  to  GAPDH  cDNA  within  each  sample.  Relative  fold   change  between  novel  and  control  samples  was  then  calculated  using  2-­ΔΔCt.  Ribosomal   18s  enrichment  between  samples  was  calculated  using  absolute  comparisons  of  the   r18s  Ct  values.  Samples  with  18s  enrichment  values  less  than  2  were  discarded  from   future  analyses.  Negative  controls  lacking  the  RT  enzyme  or  lacking  a  template  strand   were  run  in  parallel  for  all  samples  and  primers.  qRT-­PCR  primer  sequences  and   references  are  given  in  Supplementary  Table  S1.  3-­5  different  primer  pairs,  designed  in-­ house  and  from  multiple  databases,  for  each  gene  candidate  were  tested  and  validated   to  identify  one  primer  set  with  the  highest  specificity  and  amplification  efficiency.   Western  Blotting   Animals  were  sacrificed  by  cervical  dislocation  in  a  separate  room  from  the  behavioral   room.    Brain  regions  were  rapidly  dissected  on  ice  and  flash  frozen  in  liquid  nitrogen.     Brain  tissues  were  homogenized  in  (mM)  5  HEPES  pH7.4,  2  EDTA,  2  EGTA,  and  1%   SDS  and  boiled  for  10  minutes.  25  µg  total  protein  lysates  were  loaded  onto  a  4-­12%   bis-­tris  gel  (Invitrogen).    Dissociated  neuronal  cultures  were  lysed  in  2  x  sample  buffer   with  BME,  boiled  10  min  and  analyzed  by  western  blot.    SDS-­PAGE  gels  were   transferred  to  0.2  µm  pore  PVDF  membranes  (Millipore)  at  45  V  for  60  minutes  at  4°C.     Signals  from  infrared  secondary  antibodies  (Licor)  were  detected  on  an  Odyssey   scanner  (Licor)  and  quantified  using  ImageJ.    

6

Cell  Culture   Dissociated  cortical  cultures  were  prepared  from  newborn  C57BL/6Ncrl  as  previously   described  (73).     Proximity  Ligase  Assay   In  situ  PLA  was  performed  using  the  DuoLink  II  kit  (Sigma)  according  to  the  instructions   of  the  manufacturer.  The  primary  neurons  were  fixed  using  4%  paraformaldehyde  in   PBS  (PFA)  and  later  permeabilized  using  0.2%  Triton  X-­100,  subjected  to  rabbit  anti-­Ng   or  anti-­CaM  and  mouse  anti-­puromycin  incubation  and  subsequent  PLA  reaction.   Coverslips  were  mounted  with  fluorescence  mounting  medium  (Dako)  to  subject  to   confocal  microscopy.   RNA  Pull-­Down  Assay   The  RNA  pull  down  assay  was  based  on  (74).  UTR  constructs  were  cloned  into   pBluescript  SK(-­)  and  transcribed  using  T7  polymerase  (Ambion)  in  the  presence  of   Biotin-­16  UTP.    5  µg  of  in  vitro  transcribed  RNAs  was  incubated  and  attached  to  30  µl   streptavidin  dynabeads  (Invitrogen)  in  incubation  buffer  (10  mM  Tris  HCl  pH  7.4,  1  mM     EDTA,  2  M    NaCl)  for  20  min  at  room  temperature.  Hippocampi  were  homogenized  in  3   ml  ice-­cold  extraction  buffer  (NaCl  100  mM,  MgCl2  10  mM,  TrisHCl  pH  7.5,  10  mM,   Triton  X100  1%,  DTT  1  mM,  protease  inhibitor  cocktail  10  µl/ml,  phosphatase  inhibitor   cocktails  10  µl/ml,  RNaseOUT  40U/mL)  Beads  were  incubated  overnight  with  rotation  at   4°C.  Beads  were  washed  and  proteins  were  eluted  in  1%  SDS  and  separated  on  SDS-­ PAGE  gel  (Invitrogen)  for  either  western  blotting  or  Mass  Spec  (MIT  Whitehead   Proteomics  Core).  Mass  spec  was  performed  independently  two  times  and  proteins   found  in  both  samples  were  marked  in  bold  (Supplemental  Index,  Dataset  S1).    

7

Immunohistochemistry   C57BL/6Ncrl  mice  (8  weeks  old)  were  anesthetized  with  Isofluorane  (Piramal   Healthcare)  and  transcardially  perfused  with  4%  PFA.  After  post-­fixation,  brains  were   sectioned  (45  µm)  on  a  vibratome  (Leica).  Slices  were  blocked  and  permeablized  in  10%   horse  serum,  1%  goat  serum,  1%  BSA,  0.5  %  TritonX-­100  in  PBS,  incubated  overnight   at  4°C  with  anti-­Ng  (1:500)  and  anti-­synaptophysin  (Sigma,  1:1000),  then  with  secondary   antibody  goat  anti-­rabbit  488  and  goat  anti-­mouse  546  (1:  5000,  Invitrogen),  mounted  in   Prolong  Gold  anti-­fade  reagent  (Thermo-­Fisher  Scientific)  with  PBS  washes  in  between   steps.  Sections  were  imaged  with  laser  scanning  confocal  microscopy,  using  identical   gain  settings  and  laser  intensities  between  naive  and  novel  context  exposed  animals.   The  whole  brain  coronal  sections  were  taken  with  a  5x  objective  (Zeiss  710)  for  5  optical   sections  spaced  by  10  µm.  Images  of  the  DG  and  CA  regions  were  taken  with  a  63  x  oil   immerse  objective  (NA  1.40;;  WD  0.17  mm,  Zeiss  810),  for  10  to  15  optical  sections   spaced  by  0.8  µm.  at  a  resolution  of  1024  x  1024  pixels  and  processed  in  Imaris  and   Adobe  Photoshop.   Polyribosome  

profiling  

and  

RNA  

quantification  

from  

stimulated  

synaptoneurosomes     Procedures  were  described  previously  (75-­77).  Synaptoneurosomes  (SN)  were  prepared   from   1-­   to   2-­month-­old   WT   and   Fmr1   KO   male   mice   on   FVB   background.   Hippocampi   and  cortices  were  dissected  and  homogenized  in  cold  Krebs  buffer  (2.5  mM  CaCl2,  1.18   mM   KH2PO4,   118.5   mM   NaCl,   24.9   mM   NaHCO3,   1.18   mM   MgSO4,   3.8   mM   MgCl2,   212.7   mM   glucose;;   pH7.4   set   with   carbogen)   supplemented   with   1×   protease   inhibitor   cocktail  EDTA-­free  (Roche)  and  120  U/ml  RNase  Inhibitor  (RiboLock,  ThermoScientific).   Homogenates  were  passed  through  a  series  of  nylon  mesh  filters  consecutively:  100,  60,   30  and  10   µm  (Millipore),  centrifuged  at  1000  X  g  for  15  min  at  4°C.  Pellet  was  washed  

8

and   resuspended   in   Krebs   buffer   with   protease   and   RNase   inhibitors.   Next,   synaptoneurosomes   were   prewarmed   for   5   min   at   37°C   and   stimulated   with   a   pulse   of   50  µM   NMDA   and   10   µM   glutamate   for   30   sec,   then   APV   (120   µM)   was   added   and   synaptoneurosomes   were   further   incubated   for   20   min   at   37°C   (Scheetz   2000).   Unstimulated  samples,  kept  on  ice  with  200  µg/ml  cycloheximide,  were  used  as  controls.   After  the  stimulation  synaptoneurosomes  were  centrifuged  at  1000  x  g  for  15  min  at  4°C   and  the  pellet  was  lysed  in  1  ml  of  lysis  buffer  (20  mM  Tris-­HCl  pH  7.4,  2  mM  DTT,  125   mM   NaCl,   10   mM   MgCl2,   200   µg/ml   cycloheximide,   120   U/ml   RNase   inhibitor,   1   ×   protease   inhibitor   cocktail   and   1.5%   IGEPAL   CA-­630   (Sigma   Aldrich)).   After   centrifugation  at  20,000  x  g  for  15  min  at  4°C,  the  supernatant  was  loaded  on  a  10–50%   linear   density   gradient   of   sucrose   and   ultracentrifuged   at   38,000   x   rpm   for   2   h   (TH641   rotor;;   Sorvall   WX   Ultra   Series   Centrifuge;;   Thermo   Scientific).   Gradients   were   collected   using  BR-­188  Density  Gradient  Fractionation  System  (Brandel).  Based  on  the  UV  profile   fractions   were   combined   into   three   pools:   monosome,   light   polyribosomes   and   heavy   polyribosomes.   Before   the   RNA   extraction,   external   spike-­in   control   mRNA   (an   in   vitro   transcribed   fragment  of  A.  thaliana  LSm  gene,  10  ng)  was  added  to  each  of  the  fractions  to  control   the   efficiency   of   RNA   precipitation.   RNA   in   each   fraction   was   supplemented   with   linear   polyacrylamide  (20   µg/ml)  and  precipitated  with  1:10  volume  of  3  M  sodium  acetate,  pH   5.2   and   1   volume   of   isopropanol.   After   proteinase   K   digestion   RNA   was   isolated   using   phenol/chloroform  extraction  method.  RNA  pellets  were  dissolved  in  30  µl  of  RNase-­free   water.   Equal   volume   from   each   RNA   sample   (6   µl)   was   reverse   transcribed   using   random   primers   (GeneON;;   #S300;;   200   ng/RT   reaction)   and   SuperScript   IV   Reverse   Transcriptase   (Thermo   Fisher).   Next,   the   abundance   of   studied   mRNAs   in   different  

9

polysomal   fractions   was   analyzed   by   qRT-­PCR   using   Light   Cycler   480   Probes   Master   Mix  (Roche)  in  a  LightCycler480  (Roche).  The  cDNA  was  diluted  5  ×  with  H2O  and  4   µl   of   each   cDNA   sample   was   amplified   using   a   set   of   custom   sequence-­specific   primers   and   TaqMan   MGB   probes   in   a   final   reaction   volume   of   15   µl.   Following   TaqMan   Gene   Expression   Assays   (Thermo   Fisher)   were   used:   i)   Nrgn,   Neurogranin   (Ng);;   (Mus   musculus);;  

Mm01178296_g1;;  

ii)  

Gap43,  

Neuromodulin,  

(Mus  

musculus);;  

Mm00500404_m1;;   iii)   Calm1,   Calmodulin,   (Mus   musculus);;   Mm01336281_g1;;   iv)   AT3G14080,  

U6  

snRNA-­associated  

Sm-­like  

protein  

LSm1  

(Arabidopsis);;  

At02174019_g1.  Relative  mRNA  levels  in  different  fractions  were  determined  using  the   ∆Ct  (where  Ct  is  threshold  cycle)  relative  quantification  method  and  presented  as  the  %   of  mRNA  in  each  fraction.  Values  were  normalized  to  LSm  spike-­in  control.   Statistical  Analysis   Statistical  analysis  was  performed  using  Prism  (Graphpad).  Group  differences  were   determined  using  either  one-­way  ANOVA  or  two-­way  ANOVA  with  appropriate  post-­hoc   test.  One  sample  t-­test  was  used  for  comparison  of  a  group  of  data  with  a  fixed  value.     Significance  threshold  was  set  at  p  =  0.05.  

10

                              Figure  S1.  Sufficient  pre-­exposure  to  a  context  allows  associative  learning   (associated  with  Figure  1).     (A).  Schematic  for  the  contextual  memory  test.   (B).  Quantification  of  freezing  percentage  of  animals  exposed  to  a  novel  context  for  0  (n   =  10),  2  (n  =  14),  or  8  (n  =  15)  minutes.  One-­way  ANOVA,  F(2,36)  =  26.79,  p  <  0.0001,   followed  by  Tukey’s  test.  ****  p  <  0.0001.  

11

Figure  S2.  Nrgn  mRNA  Levels  are  increased  in  the  polyribosomal  fraction  but  not   in  the  total  homogenate,  unlike  the  IEGs,  following  novel  context  exposure   (associated  with  Figure  2).   (A).  Quantification  of  relative  levels  (Fold  Change  Nov/Ctrl)  of  IEG  mRNA  candidates  in   the  hippocampal  ribosome  enriched  fraction  from  novel  context-­exposed  (Nov)  animals   to  those  from  control  animals  (Ctrl).  Colored  symbols,  individual  data  points;;  colors,   different  cohorts  of  animals,  n  =  7  out  of  three  cohorts;;  mean  ±  S.E.M  is  represented  in   solid  black  lines  in  each  data  column.  One-­way  ANOVA,  F(5,36)  =  15.22,  p  <  0.0001,   followed  by  Dunnett’s  test,  compared  to  Tubb3  ratio  as  a  control.  ****  p  <  0.0001.     (B).  Quantification  of  relative  levels  (Fold  Change  Nov/Ctrl)  of  IEG  mRNA  candidates   and  selected  targets  in  the  hippocampal  input  from  novel  context-­exposed  (Nov)  animals   to  those  from  control  animals  (Ctrl).  Data  presentation  as  in  (A).  Mean  ±  S.E.M  is   represented  in  solid  black  lines  in  each  data  column.  One-­way  ANOVA,  F(7,48)  =  15.62,   p  <  0.0001,  followed  by  Dunnett’s  test,  compared  to  Tubb3  ratio  as  a  control.  ****  p  <   0.0001.    

12

                  Figure  S3.  Ng  protein  levels  are  correlated  with  the  Nrgn  mRNA  levels  in  the   polyribosome-­enriched  fraction  (Associated  with  Figure  2).       (A).  Representative  western  blot  images  of  Ng  in  hippocampal  lysate  from  control  (Ctrl)   and  novel  context  exposed  (Nov)  animals.     (B).  Correlation  of  fold  change  in  protein  levels  (Nov/Ctrl)  and  the  fold  change  in  Nrgn   mRNA  in  polyribosome  enriched  fraction  (Nov/Ctrl).  Each  colored  symbols  represents  an   individual  data  point  from  one  pair  of  comparison.  Different  cohorts  of  animals  were  color   coded.    

13

H 7500 5000 2500 0

N

10 5 0

I

15

% Center Time

10000

gN ∆IQ g3 ’U GF T P NR N g-G g3 F ’U PTR

Ng-eGFP-Ng3’UTR

G

10 5 0

N gN ∆IQ g3 ’U GF TR P N N g-G g3 F ’U PTR

Ng∆IQ-eGFP-Ng3’UTR

Total Dist (cm)

F

0

G eGF 3’ P U TR e Ng G 3’U FP TR -

G eGF 3’ P U TR Ng eG 3’U FP TR -

0

5

% Time in Open Arm

2500

10

15 10 5 0

G eGF 3’ P U TR e Ng G 3’U FP TR -

5000

15

J 15 10 5 0

N % Time in Open Arm gN ∆IQ g3 ’U GF T P NR N g-G g3 F ’U PTR

7500

15

% Center Time

eGFP-Ng3’UTR

Total Dist (cm)

10000

E

# of Open Arm Entries

eGFP-G3’UTR

D

G eGF 3’ P U TR e Ng G 3’U FP TR -

C

g# of Open Arm Entries N ∆IQ g3 ’U GF TR P N N g-G g3 F ’U PTR

B

N

A

15 10 5 0

  Figure  S4.  Expression  of  AAV  constructs  in  the  dentate  gyrus  do  not  alter  open   field  exploration  or  behavior  in  the  elevated  plus  maze  (Associated  with  Figure  4).     (A-­E).  Behavioral  validation  of  animals  injected  with  eGFP-­G3’UTR  (n  =  4)  or  eGFP-­ Ng3’UTR  (n  =  4).     (F-­J).  Behavioral  validation  of  animals  injected  with  NgΔIQ-­eGFP-­Ng3’UTR  (n  =  3)  or   Ng-­eGFP-­Ng3’UTR  (n  =  4).   Representative  images  (A,F),  total  distance  traveled  during  1h  of  exploration  of  open   field  (B,G);;  percentage  of  time  spent  in  center  quadrant  of  the  open  field  (C,H),  number   of  open  arm  entries  in  5  minutes  in  elevated  plus  maze  (D,I),  and  percentage  of  time   spent  in  the  open  arm  of  the  elevated  plus  maze  (E,J).  Mean  ±  S.E.M  is  represented  in   solid  black  lines  in  each  data  column.  Student’s  t-­test.  All  comparisons  were  not   significant.    

14

A WT Fmr1 KO n.s. stim n.s. stim mono L-poly H-poly

B

C Calm1

120

80

% mRNA

80 60

**

40

WT

60

20

m o L- no po H ly -p ol m y L- ono p H oly -p ol m y o L- no po H ly -p ol m y L- ono p H oly -p ol y

im

s.

n.s.

Fmr1 KO

stim

Gap43

% mRNA

60 40

*

n.s.

40 20 0

m o L- no po H ly -p ol m y L- ono p H oly -p ol m y o L- no po H ly -p ol m y L- ono p H oly -p ol y

% mRNA

80

stim

Fmr1 KO

n.s.

60

120 100

n.s.

WT

E

D

WT

im

st

s. n.

im

st

n.

s.

20 0

n.s.

40

st

st

n.

s.

0

**

0

n.

20

im

% mRNA

100

*

Fmr1 KO

n.s.

stim WT

n.s. stim Fmr1 KO

Figure  S5.  Calm1  and  Gap43  mRNAs  showed  different  distribution  pattern  and   activity-­sensitivity  in  the  synaptoneurosome,  compared  to  the  Nrgn  mRNA   (Associated  with  Figure  6).     (A).  The  data  representation  scheme.   (B-­E).  Quantification  of  the  stacking  percentage  (B,D)  and  the  separated  percentage   (C,F)  of  the  Calm1  mRNA  (B,C)  and  the  Gap43  mRNA  (D,E)  in  monosome  (mono),  light   polyribosome  (L-­poly),  heavy-­polyribosome  (H-­poly)  fractions  from  non-­stimulated  (NS)   and  NMDA  and  glutamate  (50  uM  and  10  uM,  NMDA+Glu)  stimulated   synaptoneurosome  preps  from  wild-­type  (WT)  and  Fmr1  knockout  (Fmr1  KO)  animals,  n   =  3  in  each  group.  Two-­way  ANOVA,  (B),  F(5,24)  =  6.99,  p  =  0.0004;;  (D),  F(5,24)  =  1.84,   p  =  0.14;;  followed  by  Fisher’s  LSD  test  for  multiple  comparison;;  *,  p  <  0.05,  **,  p  <  0.01.    

15

B

FMRP Levels (% shLuc)

150

****

100

s N hLu g- c eG sh FP N Fm geG r1 FP

A

FMRP Tub

50

Ng-eGFP

r1 Fm

Ng

sh

sh

Lu

c

0

Figure  S6.  Kockdown  of  FMRP  and  knockdown  of  FMRP  with  Ng-­eGFP   overexpression  (Associated  with  Figure  7).     (A).  Quantification  of  FMRP  (normalized  to  Tub)  in  cortical  neuron  lysates  from  shLuc   and  shFmr1  infected  neurons,  n  =  8  from  3  independent  cultures.  Mean  ±  S.E.M  is   represented  in  the  bar  graph.  Student’s  t-­test  ****  p<  0.0001.     (B).  Representative  western  blot  images  of  FMRP,  Tub,  Ng-­eGFP,  and  Ng  in  cortical   neuron  lysates  from  shLuc-­Ng-­eGFP  and  shFmr1-­Ng-­eGFP  infected  neurons.  

16

Table  S1:  Candidate  genes  selected  for  qRT-­PCR  with  selection  criteria  and  primer   references  (associated  with  Figure  2)     Primer  sequences  for  qRT-­PCR,  reference  for  primer  sources  and  selection  criteria  for   the  candidate  genes  are  listed.  All  candidate  genes  shown  meet  at  least  one  of  the   following  criteria:  1)  Activity-­dependent:  activity-­dependent  or  experience-­dependent   protein  synthesis  has  been  shown;;  2)  Dendritic  localization:  Potential  dendritic   localization  of  the  mRNA  or  direct  evidence  for  dendritic  localization  has  been  shown;;  3)   FMRP  target:  functionally  validated  as  an  FMRP  target  by  at  least  two  studies,  and  4)   Gene  homology,  whether  the  genes  was  homologous  with  another  gene  that  met  one  or   more  of  the  three  aforementioned  criteria.  

17

NCBI   Accession    

Gene  Locus  

Abbreviation  

Tubb3  

NM_023279  

Tub  

Actb  

NM_007393  

β-­Actin  

Nrgn  

NM_022029  

Ng  

Calm1  

NM_009790  

CaM  

Selection   Criteria/Source  

Reference   /Source  

Control  

1  

Actb  F:  TGTCACCAACTGGGACGATA   Actb  R:  GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA  

Activity-­ dependent  (2),   Dendritic     localization  (2,3)

4  

Nrgn  F:  CACCCTAACCTAACCTCAACC   Nrgn  R:  AACCCAGTATGGTAACATGCA  

Dendritic   localization  (5-­8)  

9  

Control  

10  

Primer   Tubb3  F:  AGCCCTCTACGACATCTGCT   Tubb3  R:  ATTGAGCTGACCAGGGAATC  

Calm1  1f:  TTGCCGTCTATGACCACGTAAG   Calm1  1r:  CCTGCTTTTGCCATACACAGTG  

Activity-­ dependent  (11-­ 14),  Dendritic   localization   (5,6,13,15),     FMRP  target   (16-­18)   Camk2a   homolog  

Camk2a  

NM_177407  

CaMKIIα  

Camk2a  F:  CCATCCTCACCACTATGCTG   Camk2a  R:  ATCGATGAAAGTCCAGGCCC  

Camk2b  

NM_007595  

CaMKIIβ  

Camk2b  F:  GAAAGCAGATGGAGTCAAG   Camk2b  R:  GTTGTGTTGGTGCTGTCG  

Dlg1  

NM_001252436  

SAP-­97  

Dlg1  F:  AGTGACGAAGTCGGAGTGATT   Dlg1  R:  GTCAGGGATCTCCCCTTTATCT  

Dlg4  homolog  

PrimerBank   (21)      ID   28502750a1  

Dlg2  

NM_001243047  

PSD-­93  

Dlg2  F:  GGGCTCTCTGCCCTAGAGTT   Dlg2  R:  AGCAGCTAAATCAGCTCTGGA  

Dlg4  homolog  

Primer  blast  

Dlg3  

NM_001177778  

SAP-­102  

Dlg3  F:  ACATTCTGCACGTCATTAACGC   Dlg3  R:  ATGTCACTCCCTTCAGGTTCT  

Dlg4  homolog  

PrimerBank   (21)      ID   7949129a1  

Activity-­ dependent  (22),   Dendritic   localization  (18),   FMRP  target   (18,23-­25)  

Primer  blast  

Dendritic   localization   (26,27)  

PrimerBank   (21)      ID   283549149c1  

19  

20  

Dlg4  

NM_001109752  

PSD-­95  

Dlg4  F:  GCCCTGAGCTTCCACTTTGG   Dlg4  R:  CCGCCGTTTGCTGGGAATGAA  

Shank1  

NM_001034115  

Shank1  

Shank1  F:  TGCATCAGACGAAATGCCTAC     Shank1  R:  AACAGTCCATAGTTCAGCACG  

Shank2  

NM_001081370  

Shank2  

Shank2  F:  GTTCCACATCCAAAGCCAAG   Shank2  R:  TGGGTGCACGTAATTCTCAG  

Dendritic   localization  (27),   Shank1  homolog  

Primer  blast  

Shank3  

NM_021423  

Shank3  

Shank3  F:  TGGCAAGAGATCCATCAGG   Shank3  R:  GTTGGCCCCATAGAACAAAA  

Dendritic   localization  (27),   Shank1  homolog  

Primer  blast  

Gria1  

NM_001113325  

GluA1  

Gria2  

NM_013540  

GluA2  

Grin1  

NM_001177656  

GluN1  

Grin2a  

NM_008170  

GluN2A  

Grin2a  F:  GACGGTCTTGGGATCTTAAC   Grin2a  R:  TGACCATGAATTGGTGCAGG  

Grin2b  

NM_008171  

GluN2B  

Grin2b  F:  CAAGAACATGGCCAACCTGT   Grin2b  R:  GGTACACATTGCTGTCCTTC  

Bdnf  

NM_001316310  

BDNF  

Activity-­ dependent  (28-­ 30),  Dendritic   localization  (18)   Dendritic   Gria2  F:  5'  AAAGAATACCCTGGAGCACAC     localization   Gria2  R:  5'  CCAAACAATCTCCTGCATTTCC     (18,30,31),  Gria1   homolog   Gria1  F:  GAGGTCCCGTAAACCTAGCG   Gria1  R:  GCTCAGAGCACTGGTCTTGT  

Grin1  F:  CTGCAACCCTCACTTTTGAG   Grin1  R:  TGCAAAAGCCAGCTGCATCT  

Bdnf  F:  AGCTGAGCGTGTGTGACAGT   Bdnf  R:  ACCCATGGGATTACACTTGG  

Primer  blast  

Primer  blast  

Dendritic   localization  (30)  

 32  

Dendritic   localization  (30),   Grin1  homolog   Dendritic   localization  (30),   Grin1  homolog   Activity-­ dependent   (33,34),  Dendritic   localization  (35)  

 32    32  

 19  

18

Eef1a1  F:  GCATCCTACCACCAACTGGT   Eef1a1  R:  CGTGTGGCAATCCAATACAG  

Activity-­ dependent  (36),   Dendritic   localization  (36)  

Primer  blast  

Control  

PrimerBank   (21)  ID   6678195a1  

Eef1a1  

NM_010106  

eEF1A1  

Syp  

NM_009305  

Syp  

Syngap1  

NM_001281491  

SynGAP1  

Syngap1  F:  TCCTGATGCAGTACCAAGCC   Syngap1  R:  CGGGTTTGTTGGACCCAAGG  

Map1b  

NM_008634  

MAP-­1B  

Map1b  F:  CATCCTGCAGTCTGGCTCT   Map1b  R:  AGGAGCTCACCAATCTCTTGA  

Map2  

NM_001310634  

MAP-­2  

Gabrb3  

NM_008071  

GABRβ3  

Gabrb3  F:  CGTGGGTGTCCTTCTGGAT   Gabrb3  R:  ATGGTGAGCACGGTGGTAAT  

Activity-­ dependent  (43)  

Primer  blast  

Dicer1  

NM_148948  

Dicer1  

Dicer1  F:  AGATGGAGGCGGAGTTCAG   Dicer1  R:  CAATGAGCAGGTTGGTCTCA  

Activity-­ dependent  (44)  

 Primer  blast  

Plat  

NM_008872  

tPA  

Plat  F:  CTGAGGTCACAGTCCAAGCA   Plat  R:  ACAGATGCTGTGAGGTGCAG  

Ctnnb1  

NM_007614  

β-­Cat  

Ctnnb  F:  GTTGTACTGCTGGGACTC   Ctnnb  R:   CAGTGTCGTGATGGCGTAGAACAG  

Gapdh  

NM_008084  

GAPDH  

   

   

   

Egr1  

NM_007913  

Egr-­1  

Fos  

NM_010234  

c-­fos  

Npas4  

NM_153553  

Npas4  

Arc  

NM_018790  

Arc  

Homer1  

NM_011982  

Homer1a  

   

   

   

Rn18s  

NR_046233  

r18s  

Syp  F:  CAGTTCCGGGTGGTCAAGG   Syp  R:  ACTCTCCGTCTTGTTGGCAC  

Map2  F:  GCCAGCCTCGGAACAAACA   Map2  R:  GCTCAGCGAATGAGGAAGGA  

Gapdh  F:  GCATCCTGCACCACCAACTG   Gapdh  R:  ACGCCACAGCTTTCCAGAGG  

Significant  PSD-­ 95  interaction   (37)   Activity-­ dependent  (17),   Dendritic   localization  (16,   38,39),  FMRP   target  (16,  40)   Activity-­ dependent  (41),   Dendritic   localization  (42)  

Activity-­ dependent  (45-­ 46)     Activity-­ dependent  (48),   FMRP  target   (49,50)  

Primer  blast  

Primer  blast  

 21  

47  

Primer  blast  

Control  

 19  

 

   

IEG  (51-­54)    

 55  

cfos  F:  ATGGGCTCTCCTGTCAACACAC   cfos  R:   ATGGCTGTCACCGTGGGGATAAAG  

IEG  (56)  

Primer  blast  

Npas4  F:   GCTATACTCAGAAGGTCCAGAAGGC   Npas4  R:   TCAGAGAATGAGGGTAGCACAGC  

IEG  (65)  

 (57)  

Arc  F:  CCCTGCAGCCCAAGTTCAAG   Arc  R:  GAAGGCTCAGCTGCCTGCTC  

IEG  (58,59),   Dendritic   localization   (6,60),  FMRP   target  (61,62)  

 (19)  

IEG  (63)  

Primer  blast  

 

   

rRNA  marker    

 (4)  

    Egr-­1  F:   TATGAGCACCTGACCACAGAGTCC   Egr-­1  R:  CGAGTCGTTTGGCTGGGATAAC  

Homer1  F:  CAAACACTGTTTATGGACTG     Homer1  R:  TGCTGAATTGAATGTGTACC       r18s  F:  ACGGACCAGAGCGAAAGCAT   r18s  R:  TGTCAATCCTGTCCGTGTCC  

           

 

 

19

Table  S2.  Commercially  Available  Research  Resource.     Antibody  dilutions  for  western  blot  (WB)  and  immunohistochemistry  (IMH)  were  shown.   Vendor  name,  catalog  number,  and  available  RRID  info  were  listed.       Antibodies   Anti-­Neurogranin   WB:  1:3000   IHC:  1:500  (Fig  2G)   Anti-­Neurogranin   IHC  1:200  (Fig  3I)   Anti-­Gapdh   WB:  1:5000   Anti-­Calmodulin   WB:  1:3000   IHC:  1:500     Anti-­Tubulin   WB:  1:5000   Anti-­hnRNP  U   WB:  1:1000   Anti-­Synaptophysin   IHC  1:1000   Anti-­Beta  Actin   WB:  1:5000   Anti-­FMRP   WB:  1:1000   Anti-­FXR2   WB:  1:1000   Anti-­PUF60   WB  1:2000   Anti  CaMKII   WB:  1:5000   Anti-­PSD-­95   WB:  1:5,000   Anti-­Puromycin   IHC:  1:500   Goat  anti-­Mouse  680LT   WB  1:10,000   Goat  anti-­Rabbit  800CW   WB1:10,000   Alexa  488  Goat  anti-­Rabbit   IHC:  1:1,000   Alexa  546  Goat  anti-­Mouse   IHC:  1:1,000   Chemicals   Anisomycin   Cycloheximide   Actinomycin  ßD   Bicuculline  Methobromide   Biotin-­16-­UTP   Puromycin  dihydrochloride   Assays  and  Kits   Doulink®  In  Situ  Detection  Kit   Duolink®  In  situ  anti-­rabbit  Plus  

  Millipore  Cat#07-­425;;  RRID:AB_310605   Millipore  Cat#  AB5620  RRID:AB_91937   Millipore  Cat#  MAB374  RRID:AB_2107445   Millipore  Cat#  05-­173  RRID:AB_309644   Sigma-­Aldrich  Cat#  T6074  RRID:AB_477582   Millipore  Cat#  05-­1516  RRID:AB_10563506   Sigma-­Aldrich  Cat#  S5768  RRID:AB_477523   Sigma-­Aldrich  Cat#  A2228  RRID:AB_476697   Abcam  Cat#  ab27455  RRID:AB_732400   Abcam  Cat#  ab65122  RRID:AB_1140561   Abcam  Cat#  ab184538   Epitomics  Cat#2716-­1  RRID:AB_2049246   Thermo  Fisher  Scientific  Cat#  MA1-­046   RRID:AB_2092361   Millipore  Cat#MABE343  RRID:AB_2566826   Licor  Cat#  925-­68020   Licor  Cat#  925-­32211   Thermo-­Fisher  Scientific  Cat#  A-11034   Thermo-­Fisher  Scientific  Cat#  A-11003     Sigma  Cat#A9789   Sigma  Cat#C7698   Sigma  Cat#A9415   Tocris  Cat#0109   Sigma  Cat#11388908910   Sigma  Cat#P8833     Sigma  Cat#DUO92008   Sigma  Cat#DUO92002  

20

Duolink®  In  situ  anti-­mouse  Minus   Puromycin  dihydrochloride   Streptavadin  MyOne  T1  Dynabeads   Ambion  MegaScript®  T7  Transcription  Kit   Ambion  MegaScript®  T3  Transcription  Kit   Fugene®  6   Cell  Lines   HEK-­293T   Experimental  Models:  Organisms/Strains   C57BL/6Ncrl   FMR1  Knockout   Software  and  Algorithms   Scaffold  4  Reader   Prism   ImageJ   Imaris   Venny  2.1   Ethovision   VersaMax   Freezeframe/Freezeview  

Sigma  Cat#DUO92004   Sigma  Cat#P8833   Thermo-­Fisher  Scientific  Cat#65601   Thermo  -­Fisher  Scientific  Cat#1334   Thermo  -­Fisher  Scientific  Cat#1338   Promega  E2692     ATCC  Cat#  CRL-­11268,  RRID:CVCL_1926       Charles  River  Laboratories   Gift  from  Mark  Bear  Laboratory   Originally  from  Jackson  Labs   Strain  003025     Proteome  Software,  Portland,  Oregon   GraphPad  Software  Inc.  La  Jolla,  CA.   NIH  ImageJ   Bitplane,  Oxford  Instruments   http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/   Noldus  Software,  Leesburg,  VA.   AccuScan  Instruments  Columbus  OH.   Actimetrics,  Wilmette  IL.  

21

Dataset  S1:  Proteins  identified  from  hippocampal  lysate  interacting  with  the  3’UTR   constructs   Only  proteins  identified  with  at  least  3  unique  peptides  were  included  in  the  table   (A).  Proteins  interacting  with  Beads  alone  (background)     (B).  Proteins  identified  interacting  with  G3’UTR,  but  not  beads  alone     (C).  Proteins  identified  interacting  with  Ng3’UTR,  but  not  beads  alone   (D).  Proteins  identified  interacting  with  Ng3’UTR  389-­577,  but  not  beads  alone   (E).  Proteins  identified  interacting  with  Ng3’UTR,  but  not  beads,  G3’UTR,  or  Ng3’UTR   389-­577.  Proteins  shown  in  bold  were  identified  in  two  independent  mass  spec  samples,   in  this  and  subsequent  sheets.     (F).  Proteins  identified  interacting  with  Ng3’UTR  and  Ng3’UTR  389-­577,  but  not  beads  or   G3’UTR.   (G).  Proteins  identified  exclusively  in  Ng3’UTR  389-­577.     (H).  Proteins  identified  exclusively  in  G3’UTR.     (I).  Proteins  identified  interacting  with  Ng3’UTR  and  GAPDH3’UTR,  but  not  beads,  or   Ng3’UTR  389-­577.     (J).  Proteins  identified  interacting  with  Ng3’UTR  389-­577  and  GAPDH3’UTR,  but  not   beads,  or  Ng3’UTR.     (K).  Proteins  identified  interacting  with  Ng3’UTR,  Ng3’UTR  389-­577,  and  GAPDH3’UTR,   but  not  beads.    

22

Reference     1.     Lee  H-­R,  et  al.  (2016)  Discovery  of  a  Small  Molecule  that  Enhances   Astrocytogenesis  by  Activation  of  STAT3,  SMAD1/5/8,  and  ERK1/2  via  Induction   of  Cytokines  in  Neural  Stem  Cells.  ACS  Chem  Neurosci  7(1):90–99.   2.     Tiruchinapalli  DM,  et  al.  (2003)  Activity-­Dependent  Trafficking  and  Dynamic   Localization  of  Zipcode  Binding  Protein  1  and  β-­Actin  mRNA  in  Dendrites  and   Spines  of  Hippocampal  Neurons.  J  Neurosci  23(8):3251–3261.   3.     Kleiman  R,  Banker  G,  Steward  O  (1994)  Development  of  subcellular  mRNA   compartmentation  in  hippocampal  neurons  in  culture.  J  Neurosci  14(3):1130– 1140.   4.     Bonefeld  BE,  Elfving  B,  Wegener  G  (2008)  Reference  genes  for  normalization:  A   study  of  rat  brain  tissue.  Synapse  62(4):302–309.   5.     Pinkstaff  JK,  Chappell  SA,  Mauro  VP,  Edelman  GM,  Krushel  LA  (2001)  Internal   initiation  of  translation  of  five  dendritically    localized  neuronal  mRNAs.  Proc  Natl   Acad  Sci  U  S  A  98(5):2770–2775.   6.     Gao  Y,  Tatavarty  V,  Korza  G,  Levin  MK,  Carson  JH  (2008)  Multiplexed  Dendritic   Targeting  of  α  Calcium  Calmodulin-­dependent  Protein  Kinase  II,  Neurogranin,   and  Activity-­regulated  Cytoskeleton-­associated  Protein  RNAs  by  the  A2   Pathway.  Mol  Biol  Cell  19(5):2311–2327.   7.     Mori  Y,  Imaizumi  K,  Katayama  T,  Yoneda  T,  Tohyama  M  (2000)  Two  cis-­acting   elements  in  the  3′  untranslated  region  of  α-­CaMKII  regulate  its  dendritic  targeting.   Nat  Neurosci  3(11):1079.   8.     Taliaferro  JM,  et  al.  (2016)  Distal  Alternative  Last  Exons  Localize  mRNAs  to   Neural  Projections.  Mol  Cell  61(6):821–833.   9.     Li  L,  et  al.  (2008)  The  effects  of  retinoic  acid  on  the  expression  of  neurogranin   after  experimental  cerebral  ischemia.  Brain  Res  1226:234–240.   10.     Gao  X,  et  al.  (2012)  Expression  of  calmodulin  in  germ  cells  is  associated  with   fenvalerate-­induced  male  reproductive  toxicity.  Arch  Toxicol  86(9):1443–1451.   11.     Wu  L,  et  al.  (1998)  CPEB-­Mediated  Cytoplasmic  Polyadenylation  and  the   Regulation  of  Experience-­Dependent  Translation  of  α-­CaMKII  mRNA  at   Synapses.  Neuron  21(5):1129–1139.   12.     Ouyang  Y,  Rosenstein  A,  Kreiman  G,  Schuman  EM,  Kennedy  MB  (1999)  Tetanic   Stimulation  Leads  to  Increased  Accumulation  of  Ca2+/Calmodulin-­Dependent   Protein  Kinase  II  via  Dendritic  Protein  Synthesis  in  Hippocampal  Neurons.  J   Neurosci  19(18):7823–7833.   13.     Aakalu  G,  Smith  WB,  Nguyen  N,  Jiang  C,  Schuman  EM  (2001)  Dynamic   Visualization  of  Local  Protein  Synthesis  in  Hippocampal  Neurons.  Neuron   30(2):489–502.   14.     Wells  DG,  et  al.  (2001)  A  Role  for  the  Cytoplasmic  Polyadenylation  Element  in   NMDA  Receptor-­Regulated  mRNA  Translation  in  Neurons.  J  Neurosci   21(24):9541–9548.   15.     Mayford  M,  Baranes  D,  Podsypanina  K,  Kandel  ER  (1996)  The  3′-­untranslated   region  of  CaMKIIα  is  a  cis-­acting  signal  for  the  localization  and  translation  of   mRNA  in  dendrites.  Proc  Natl  Acad  Sci  93(23):13250–13255.   16.     Zalfa  F,  et  al.  (2003)  The  Fragile  X  Syndrome  Protein  FMRP  Associates  with   BC1  RNA  and  Regulates  the  Translation  of  Specific  mRNAs  at  Synapses.  Cell   112(3):317–327.   17.     Hou  L,  et  al.  (2006)  Dynamic  Translational  and  Proteasomal  Regulation  of   Fragile  X  Mental  Retardation  Protein  Controls  mGluR-­Dependent  Long-­Term   Depression.  Neuron  51(4):441–454.  

23

18.    

19.     20.     21.     22.     23.     24.     25.     26.     27.    

28.     29.     30.     31.     32.     33.     34.    

Muddashetty  RS,  Kelić  S,  Gross  C,  Xu  M,  Bassell  GJ  (2007)  Dysregulated   Metabotropic  Glutamate  Receptor-­Dependent  Translation  of  AMPA  Receptor  and   Postsynaptic  Density-­95  mRNAs  at  Synapses  in  a  Mouse  Model  of  Fragile  X   Syndrome.  J  Neurosci  27(20):5338–5348.   Raju  CS,  et  al.  (2011)  In  neurons,  activity-­dependent  association  of  dendritically   transported  mRNA  transcripts  with  the  transacting  factor  CBF-­A  is  mediated  by   A2RE/RTS  elements.  Mol  Biol  Cell  22(11):1864–1877.   van  Woerden  GM,  et  al.  (2009)  βCaMKII  controls  the  direction  of  plasticity  at   parallel  fiber–Purkinje  cell  synapses.  Nat  Neurosci  12(7):823–825.   Spandidos  A,  Wang  X,  Wang  H,  Seed  B  (2010)  PrimerBank:  a  resource  of   human  and  mouse  PCR  primer  pairs  for  gene  expression  detection  and   quantification.  Nucleic  Acids  Res  38(suppl_1):D792–D799.   Ehlers  MD  (2003)  Activity  level  controls  postsynaptic  composition  and  signaling   via  the  ubiquitin-­proteasome  system.  Nat  Neurosci  6(3):231–242.   Todd  PK,  Mack  KJ,  Malter  JS  (2003)  The  fragile  X  mental  retardation  protein  is   required  for  type-­I  metabotropic  glutamate  receptor-­dependent  translation  of   PSD-­95.  Proc  Natl  Acad  Sci  100(24):14374–14378.   Zalfa  F,  et  al.  (2007)  A  new  function  for  the  fragile  X  mental  retardation  protein  in   regulation  of  PSD-­95  mRNA  stability.  Nat  Neurosci  10(5):578–587.   Fernández  E,  et  al.  (2015)  FXR2P  Exerts  a  Positive  Translational  Control  and  Is   Required  for  the  Activity-­Dependent  Increase  of  PSD95  Expression.  J  Neurosci   35(25):9402–9408.   Zitzer  H,  Hönck  H-­H,  Bächner  D,  Richter  D,  Kreienkamp  H-­J  (1999)  Somatostatin   Receptor  Interacting  Protein  Defines  a  Novel  Family  of  Multidomain  Proteins   Present  in  Human  and  Rodent  Brain.  J  Biol  Chem  274(46):32997–33001.   Böckers  TM,  et  al.  (2004)  Differential  expression  and  dendritic  transcript   localization  of  Shank  family  members:  identification  of  a  dendritic  targeting   element  in  the  3′  untranslated  region  of  Shank1  mRNA.  Mol  Cell  Neurosci   26(1):182–190.   Ju  W,  et  al.  (2004)  Activity-­dependent  regulation  of  dendritic  synthesis  and   trafficking  of  AMPA  receptors.  Nat  Neurosci  7(3):244–253.   Grooms  SY,  et  al.  (2006)  Activity  Bidirectionally  Regulates  AMPA  Receptor   mRNA  Abundance  in  Dendrites  of  Hippocampal  Neurons.  J  Neurosci   26(32):8339–8351.   Miyashiro  K,  Dichter  M,  Eberwine  J  (1994)  On  the  nature  and  differential   distribution  of  mRNAs  in  hippocampal  neurites:  implications  for  neuronal   functioning.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A  91(23):10800–10804.   Eberwine  J,  Miyashiro  K,  Kacharmina  JE,  Job  C  (2001)  Local  translation  of   classes  of  mRNAs  that  are  targeted  to  neuronal  dendrites.  Proc  Natl  Acad  Sci   98(13):7080–7085.   Pickering  C,  Gustafsson  L,  Cebere  A,  Nylander  I,  Liljequist  S  (2006)  Repeated   maternal  separation  of  male  Wistar  rats  alters  glutamate  receptor  expression  in   the  hippocampus  but  not  the  prefrontal  cortex.  Brain  Res  1099(1):101–108.   Patterson  SL,  Grover  LM,  Schwartzkroin  PA,  Bothwell  M  (1992)  Neurotrophin   expression  in  rat  hippocampal  slices:  A  stimulus  paradigm  inducing  LTP  in  CA1   evokes  increases  in  BDNF  and  NT-­3  mRNAs.  Neuron  9(6):1081–1088.   Bozzi  Y,  et  al.  (1995)  Monocular  deprivation  decreases  the  expression  of   messenger  RNA  for  brain-­derived  neurotrophic  factor  in  the  rat  visual  cortex.   Neuroscience  69(4):1133–1144.  

24

35.     36.     37.     38.     39.     40.     41.     42.     43.     44.     45.     46.     47.     48.    

49.     50.     51.     52.    

Tongiorgi  E,  Righi  M,  Cattaneo  A  (1997)  Activity-­Dependent  Dendritic  Targeting   of  BDNF  and  TrkB  mRNAs  in  Hippocampal  Neurons.  J  Neurosci  17(24):9492– 9505.   Huang  F,  Chotiner  JK,  Steward  O  (2005)  The  mRNA  for  Elongation  Factor  1α  Is   Localized  in  Dendrites  and  Translated  in  Response  to  Treatments  That  Induce   Long-­Term  Depression.  J  Neurosci  25(31):7199–7209.   Kim  JH,  Liao  D,  Lau  L-­F,  Huganir  RL  (1998)  SynGAP:  a  Synaptic  RasGAP  that   Associates  with  the  PSD-­95/SAP90  Protein  Family.  Neuron  20(4):683–691.   Tucker  RP,  Garner  CC,  Matus  A  (1989)  In  situ  localization  of  microtubule-­ associated  protein  mRNA  in  the  developing  and  adult  rat  brain.  Neuron   2(3):1245–1256.   Dictenberg  JB,  Swanger  SA,  Antar  LN,  Singer  RH,  Bassell  GJ  (2008)  A  Direct   Role  for  FMRP  in  Activity-­Dependent  Dendritic  mRNA  Transport  Links  Filopodial-­ Spine  Morphogenesis  to  Fragile  X  Syndrome.  Dev  Cell  14(6):926–939.   Menon  L,  Mader  SA,  Mihailescu  M-­R  (2008)  Fragile  X  mental  retardation  protein   interactions  with  the  microtubule  associated  protein  1B  RNA.  RNA  14(8):1644– 1655.   Steward  O,  Halpain  S  (1999)  Lamina-­Specific  Synaptic  Activation  Causes   Domain-­Specific  Alterations  in  Dendritic  Immunostaining  for  MAP2  and  CAM   Kinase  II.  J  Neurosci  19(18):7834–7845.   Garner  CC,  Tucker  RP,  Matus  A  (1988)  Selective  localization  of  messenger  RNA   for  cytoskeletal  protein  MAP2  in  dendrites.  Nature  336(6200):674–677.   Sperk  G,  Schwarzer  C,  Tsunashima  K,  Kandlhofer  S  (1998)  Expression  of   GABAA  receptor  subunits  in  the  hippocampus  of  the  rat  after  kainic  acid-­induced   seizures.  Epilepsy  Res  32(1):129–139.   Huang  Y-­WA,  Ruiz  CR,  Eyler  ECH,  Lin  K,  Meffert  MK  (2012)  Dual  Regulation  of   miRNA  Biogenesis  Generates  Target  Specificity  in  Neurotrophin-­Induced  Protein   Synthesis.  Cell  148(5):933–946.   Seeds  NW,  Williams  BL,  Bickford  PC  (1995)  Tissue  Plasminogen  Activator   Induction  in  Purkinje  Neurons  After  Cerebellar  Motor  Learning.  Science   270(5244):1992–1994.   Shin  CY,  Kundel  M,  Wells  DG  (2004)  Rapid,  Activity-­Induced  Increase  in  Tissue   Plasminogen  Activator  Is  Mediated  by  Metabotropic  Glutamate  Receptor-­ Dependent  mRNA  Translation.  J  Neurosci  24(42):9425–9433.   Xin  H,  et  al.  (2010)  Increasing  tPA  Activity  in  Astrocytes  Induced  by  Multipotent   Mesenchymal  Stromal  Cells  Facilitate  Neurite  Outgrowth  after  Stroke  in  the   Mouse.  PLoS  ONE  5(2).  doi:10.1371/journal.pone.0009027.   Kundel  M,  Jones  KJ,  Shin  CY,  Wells  DG  (2009)  Cytoplasmic  Polyadenylation   Element-­Binding  Protein  Regulates  Neurotrophin-­3-­Dependent  β-­Catenin  mRNA   Translation  in  Developing  Hippocampal  Neurons.  J  Neurosci  29(43):13630– 13639.   Akins  MR,  et  al.  (2017)  Axonal  ribosomes  and  mRNAs  associate  with  fragile  X   granules  in  adult  rodent  and  human  brains.  Hum  Mol  Genet  26(1):192–209.   Chyung  E,  LeBlanc  HF,  Fallon  JR,  Akins  MR  (2018)  Fragile  X  granules  are  a   family  of  axonal  ribonucleoprotein  particles  with  circuit-­dependent  protein   composition  and  mRNA  cargos.  J  Comp  Neurol  526(1):96–108.   Milbrandt  J  (1987)  A  nerve  growth  factor-­induced  gene  encodes  a  possible   transcriptional  regulatory  factor.  Science  238(4828):797–799.   Lemaire  P,  Revelant  O,  Bravo  R,  Charnay  P  (1988)  Two  mouse  genes  encoding   potential  transcription  factors  with  identical  DNA-­binding  domains  are  activated   by  growth  factors  in  cultured  cells.  Proc  Natl  Acad  Sci  85(13):4691–4695.  

25

53.     54.     55.     56.     57.     58.     59.     60.     61.     62.     63.     64.   65.   66.   67.   68.   69.   70.   71.   72.   73.  

Saffen  DW,  et  al.  (1988)  Convulsant-­induced  increase  in  transcription  factor   messenger  RNAs  in  rat  brain.  Proc  Natl  Acad  Sci  85(20):7795–7799.   Cole  AJ,  Saffen  DW,  Baraban  JM,  Worley  PF  (1989)  Rapid  increase  of  an   immediate  early  gene  messenger  RNA  in  hippocampal  neurons  by  synaptic   NMDA  receptor  activation.  Nature  340(6233):474–476.   Ramamoorthi  K,  et  al.  (2011)  Npas4  Regulates  a  Transcriptional  Program  in  CA3   Required  for  Contextual  Memory  Formation.  Science  334(6063):1669–1675.   Greenberg  ME,  Ziff  EB  (1984)  Stimulation  of  3T3  cells  induces  transcription  of   the  c-­fos  proto-­oncogene.  Nature  311(5985):433–438.   Lin  Y,  et  al.  (2008)  Activity-­dependent  regulation  of  inhibitory  synapse   development  by  Npas4.  Nature  455(7217):1198–1204.   Link  W,  et  al.  (1995)  Somatodendritic  expression  of  an  immediate  early  gene  is   regulated  by  synaptic  activity.  Proc  Natl  Acad  Sci  92(12):5734–5738.   Lyford  GL,  et  al.  (1995)  Arc,  a  growth  factor  and  activity-­regulated  gene,  encodes   a  novel  cytoskeleton-­associated  protein  that  is  enriched  in  neuronal  dendrites.   Neuron  14(2):433–445.   Steward  O,  Wallace  CS,  Lyford  GL,  Worley  PF  (1998)  Synaptic  Activation   Causes  the  mRNA  for  the  IEG  Arc  to  Localize  Selectively  near  Activated   Postsynaptic  Sites  on  Dendrites.  Neuron  21(4):741–751.   Waung  MW,  Pfeiffer  BE,  Nosyreva  ED,  Ronesi  JA,  Huber  KM  (2008)  Rapid   Translation  of  Arc/Arg3.1  Selectively  Mediates  mGluR-­Dependent  LTD  through   Persistent  Increases  in  AMPAR  Endocytosis  Rate.  Neuron  59(1):84–97.   Park  S,  et  al.  (2008)  Elongation  Factor  2  and  Fragile  X  Mental  Retardation   Protein  Control  the  Dynamic  Translation  of  Arc/Arg3.1  Essential  for  mGluR-­LTD.   Neuron  59(1):70–83.   Nedivi  E,  Hevroni  D,  Naot  D,  Israeli  D,  Citri  Y  (1993)  Numerous  candidate   plasticity-­related  genes  revealed  by  differential  cDNA  cloning.  Nature   363(6431):718–722.   Zhang  F,  et  al.  (2007)  Multimodal  fast  optical  interrogation  of  neural  circuitry.   Nature  446(7136):633-­639.   Huang  X,  et  al.  (2015)  Progressive  maturation  of  silent  synapses  governs  the   duration  of  a  critical  period.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A  112(24):E3131-­3140.   Edbauer  D,  et  al.  (2010)  Regulation  of  synaptic  structure  and  function  by  FMRP-­ associated  microRNAs  miR-­125b  and  miR-­132.  Neuron  65(3):373-­384.   Han  KS,  Cooke  SF,  &  Xu  W  (2017)  Experience-­Dependent  Equilibration  of   AMPAR-­Mediated  Synaptic  Transmission  during  the  Critical  Period.  Cell  Rep   18(4):892-­904.   Grieger  JC,  Choi  VW,  &  Samulski  RJ  (2006)  Production  and  characterization  of   adeno-­associated  viral  vectors.  Nat  Protoc  1(3):1412-­1428.   Zolotukhin  S,  et  al.  (1999)  Recombinant  adeno-­associated  virus  purification  using   novel  methods  improves  infectious  titer  and  yield.  Gene  Ther  6(6):973-­985.   Frankland  PW,  et  al.  (2004)  Consolidation  of  CS  and  US  representations  in   associative  fear  conditioning.  Hippocampus  14(5):557-­569.   Heiman  M,  et  al.  (2008)  A  translational  profiling  approach  for  the  molecular   characterization  of  CNS  cell  types.  Cell  135(4):738-­748.   Ingolia  NT,  Brar  GA,  Rouskin  S,  McGeachy  AM,  &  Weissman  JS  (2012)  The   ribosome  profiling  strategy  for  monitoring  translation  in  vivo  by  deep  sequencing   of  ribosome-­protected  mRNA  fragments.  Nat  Protoc  7(8):1534-­1550.   Liu  M,  Lewis  LD,  Shi  R,  Brown  EN,  &  Xu  W  (2014)  Differential  requirement  for   NMDAR  activity  in  SAP97beta-­mediated  regulation  of  the  number  and  strength  of   glutamatergic  AMPAR-­containing  synapses.  J  Neurophysiol  111(3):648-­658.  

26

74.   75.   76.   77.  

Fernandez  E,  et  al.  (2015)  FXR2P  Exerts  a  Positive  Translational  Control  and  Is   Required  for  the  Activity-­Dependent  Increase  of  PSD95  Expression.  J  Neurosci   35(25):9402-­9408.   Kuzniewska  B,  Chojnacka  M,  Milek  J,  &  Dziembowska  M  (2018)  Preparation  of   polysomal  fractions  from  mouse  brain  synaptoneurosomes  and  analysis  of   polysomal-­bound  mRNAs.  J  Neurosci  Methods  293:226-­233.   Dziembowska  M,  et  al.  (2012)  Activity-­dependent  local  translation  of  matrix   metalloproteinase-­9.  J  Neurosci  32(42):14538-­14547.   Scheetz  AJ,  Nairn  AC,  &  Constantine-­Paton  M  (2000)  NMDA  receptor-­mediated   control  of  protein  synthesis  at  developing  synapses.  Nat  Neurosci  3(3):211-­216.  

 

27