Primer design using Primer 3 Plus

Primer  design  using  Primer  3  Plus  

Rat  Genome  database:  Gives  rat  data  including  genomics,  gene:cs,  physiology  and   func:onal  data.       Also,  has  informa:on  on  other  species:  Mouse,  Humans  and  Chinchilla   Go  to  www.rgd.mcw.edu    

Click  on  Gene  search  

Choose  Rat  from  the   species  drop  down  box  

We  entered  GAPDH.  It  returned  253   GAPDH  genes  found  in  rats.    

When  you  click  on  your  gene  of   interest  it  shows  all  the   informa:on  associated  with  it.    

Scrolling  down  you  will  find   Nucleo:de  Sequence  linked  to   the  gene  

Clicking  on  the  nucleo:de   sequence  opens  up  the   sequence  on  NCBI  Genbank.    

Copy  the  FASTA  sequence  and  either  save  it   as  a  text  file  (recommended)  or  copy  to   clipboard  

Open     hTp://www.bioinforma:cs.nl/cgi-­‐bin/ primer3plus/primer3plus.cgi/    

Paste  your  sequence    in  the  “source   sequence  below”.  Or  you  can  also  upload   the  saved  text  file.     You  could  also  give  it  a  sequence  ID  (some   name)  

Go  to  General  seZngs:   a)  Product  size  range:  Size  of  your  amplicon.  Op:mal  amplicon  would  be  ~  120  bp.   b)  Amplicon  of  70-­‐200  bp  are  acceptable.  You  could  also  give  different  product  size  range   seperated  by  a  comma.  Eg:  70-­‐200,  80-­‐150.  This  will  look  for  primers  first  from  70-­‐200  bp   and  then  look  for  primers  between  80-­‐150.    

c)  Primer  size:  Op:mal  length  of  primers  is  acceptable  as  18-­‐28  bp  in  length.   d)  Primer  Tm:  Min  =  57,  Max  =    63  and  Opt  =  60.  Maximum  Tm  difference  =  3.  This  is  the   difference  between  the  forward  and  reverse  primers.   e)  Primer  GC%:  Min  =  40,  Max  =  60  and  Opt  =  50.  The  GC  content  of  the  primer  is  sued  to   predict  the  annealing  temperature.  Op:mal  GC%  of  primers  are  between  50-­‐60%  

Go  to  ADVANCED  SETTINGS:       a)  Number  to  return:  The  number  of  primers  would  be  returned  aher  search.  Set  to  10  (less  or  more   depends  on  the  user).       b)  Max  3’  Self  complementarity:  Set  to  0.  If  no  primers  are  returned  increase  it  by  1  un:l  you  get  primers.   The  3’  end  of  the  primer  shouldn’t  be  complimentary  to  each  other  or  it  would  result  in  primer-­‐dimer   forma:on   c)  Max  Poly  X:  Runs  of  3  or  more  Cs  or  Gs  at  the  3’  end  should  be  avoided  as  their  presence  may  promote   mispriming  at  C  or  C-­‐rich  sequence.  Set  the  value  to  1  and  increase  by  increment  of  1  if  there  are  no   results  

Aher  making  the  seZngs,  click  on   Pick  Primers  and  it  would  display  the   primers  

Check  on  all  the  primers  you  are  interested  in   tes:ng  and  click  on  Send  to  Prime3  Manager  

It  would  open  a  new  tab  with  the   selected  primers.  

You  can  click  on  CHECK  on   each  primer  and  check  for   any  errors  

Addi:onally,  you  can  BLAST  all  the   primers  and  check    

Aher  running  BLAST,  look  for  your  accession  number   and  check  for  the  E-­‐value  and  Query  coverage.   Generally,  the  Query  coverage  should  be  100%  

References  and  Further  reading   •  Real-­‐Time  PCR  (qPCR)  Primer  Design  Using  Free   Online  Sohware:  Brenda  Thornton  and  Chhandak   Basu   •  qPCR  guide:  Eurogentec   •  qPCR  technical  guide:  Sigma-­‐Aldrich