Section: Technical notes

Journal of Endocytobiosis and Cell Research (2010) 102-108 | International Society of Endocytobiology zs.thulb.uni-jena.de/content/main/journals/ecb/info.xml

Technical notes:

Journal of Endocytobiosis and Cell Research

Axenic bryophyte in vitro cultivation Anna K. Beike1,2, Nelly A. Horst1,2 and Stefan A. Rensing1* 1 Freiburg Initiative for Systems Biology, Faculty of Biology, University of Freiburg, Hauptstr. 1, D-79104 Freiburg, Germany; 2Present address: Plant Biotechnology, Faculty of Biology, University of Freiburg, Schänzlestr. 1, D-79104 Freiburg, Germany; correspondence to: [email protected]

Standardized in vitro cultivation of plant model organ­ isms is a powerful tool for modern plant science, rang­ ing from evo­devo or physiological studies to functional  genomics  and  biotechnology.  Bryophytes  (comprising  liverworts,  mosses,  and  hornworts)  are  representa­ tives of early diverging land plants and share a unique  life  strategy,  with  the  haploid  gametophyte  being  the  dominant  generation.  Next  to  their  interesting  phy­ logenetic  position  and  physiology  (e.g.,  desiccation  tolerance)  they  possess  large  varieties  of  metabolites  and  other  biologically  active  compounds,  which  pro­ vide  a  high  potential  for  applied  as  well  as  basic  re­ search.  In  vitro  cultivation  of  bryophytes  serves  as  basis  for  investigations  on  these  plants  under  highly  standardized  conditions,  and  potentially  facilitates  an  ex  situ  conservation  of  endangered  species.  Here,  we  describe  protocols  for  axenic  in  vitro  cultivation  of  mosses and liverworts, starting from non­axenic mate­ rial  collected  in  the  field.  The  protocols  include  spore  and  thallus  sterilization  procedures,  media  prepara­ tion,  and  cultivation  under  standardized  conditions.  These  methods  can  be  used  to  establish  further  bryo­ phyte model organisms for basic and applied research.  Journal  of  Endocytobiosis  and  Cell  Research  (2010)  102‐ 108   Category: technical notes   Keywords:  Bryophytes,  Physcomitrella  patens,  Marchantia  polymorpha, in vitro cultivation    Received:  24  November  2010;  Accepted:  29  December  2010  ____________________________________________________________________   

Introduction  Extant  bryophytes  (comprising  liverworts,  mosses  and  hornworts)  diverged  from  the  vascular  plant  lineage  early  during  land  plant  evolution,  at  least  450  million  years  ago  (Zimmer  et  al.  2007).  In  bryophytes,  the  haploid  gameto‐ phyte  is  the  dominant  generation,  whereas  the  diploid  sporophyte  (representing  the  dominant  generation  in  vas‐ cular plants) was probably reduced early during land plant  evolution  (Kenrick  and  Crane  1997;  Graham  et  al.  2000;  Taylor  et  al.  2005).  The  unique  phylogenetic  position  of  bryophytes  (bridging  the  evolutionary  gap  between  green  102

algae  and  vascular  plants),  in  combination  with  their  par‐ ticular physiology, makes bryophytes important groups for  evolutionary and developmental biology, plant systematics  and physiology. The physiology of the gametophyte, includ‐ ing  its  poikilohydric  way  of  life  and  its  high  abiotic  stress  tolerance,  provides  interesting  research  aspects,  e.g.  with  regard to crop improvement. In addition, some bryophytes  possess  an  enormous  variety  of  metabolites  and  biologi‐ cally  active  compounds  which  provide  potential  for  bio‐ technological and biopharmaceutical approaches (Asakawa  1981; Zinsmeister et al. 1991; Lang et al. 2005; Saavedra et  al. 2006; Asakawa 2007; Rensing et al. 2007). In vitro culti‐ vation of  bryophytes is the basis for use of these plants  in  the laboratory under standardized conditions.   The  moss  Physcomitrella  patens  Hedw.  (Bruch  &  Schimp.)  is  a  pioneering  example  for  a  bryophyte  devel‐ oped  into  a  scientific  model  organism  (Reski  1998,  2003;  Cove 2005; Frank et al. 2005; Cove et al. 2006; Beike et al.  2010;  Prigge  and  Bezanilla  2010).  Amongst  others,  one  important advantage of P. patens (Funariaceae) is the easy  way  of  axenic  (i.e.,  not  containing  any  other  organisms)  in  vitro  cultivation  on  solid  mineral  medium  (Reski  and  Abel  1985)  and  in  liquid  culture  in  flasks  or  bioreactors  (Hohe  and  Reski  2002;  Decker  and  Reski  2004;  Hohe  and  Reski  2005). Different substrates can be used for cultivation of P.  patens  and  other  Funariaceae.  Commonly  used  mineral  (minimal)  media  are  e.g.  Knop  medium  (Reski  and  Abel  1985),  BCD  medium  (Cove  et  al.  2009),  or  supplemented  (full)  media  as  described  by  (Ashton  and  Cove  1977)  and  (Schween et al. 2003). In addition, autoclaved peat and sea  sand  can  be  used  to  cultivate  P.  patens.  Standard  growth  conditions  vary  between  different  laboratories  in  terms  of  temperature (20‐25°C), light flux (50‐100 µmol m‐2 s‐1) and  light/dark regime (usually long day or continuous light). In  the  present  study,  P.  patens  and  other  bryophytes  were  grown under long day conditions with a 16h light (70 μmol  m‐2  s‐1  white  light),  8h  dark  regime  at  22°C  (Wolf  et  al.  2010). It should be noted that conditions suitable for induc‐ tion of sexual organs, and thus for completion of the sexual  cycle,  may  vary  from  those  used  for  vegetative  cultivation  (Hohe et al. 2002).  Routine  in  vitro  cultivation  procedures  do  not  neces‐ sarily  work  well  for  bryophytes  in  general.  Especially  among hornworts and liverworts, axenic cultivation can be  hindered  by  obligate  symbiotic  partners,  like  fungi  or  cyanobacteria  (Duckett  et  al.  2004).  Also,  the  feasibility  of  in vitro cultivation among mosses strongly depends on e.g.  the  nutrient  requirements  of  the  species  in  question.  It  is  well  conceivable  that  e.g.  shade‐adapted  forest  mosses  would  not  thrive  under  the  relatively  bright  illumination  used here, or that species usually growing on poor soil will  not  be  able  to  grow  on  the  abundant  amount  of  minerals  used.  Indeed,  in  our  experience,  not  all  mosses  are  as  un‐ Journal of Endocytobiosis and Cell Research VOL 20 | 2010

Bryophyte in vitro culture, Beike AK et al.

complicated concerning their cultivation as species belong‐ ing  to  the  Funariaceae.  Here,  we  present  results  derived  from  establishment  of  several  species  from  different  moss  families  and  one  liverwort  (Figure  1D‐L)  in  axenic  culture  based on surface sterilization with sodium hypochlorite.     Sterilization of sporophytes and spores   Mature spore capsules (Figure 1A) of different mosses were  collected  in  the  field  and  the  species  determined  by  the  collectors.  The  sterilization  procedure  was  performed  at  a  laminar  flow  clean  bench  with  freshly  prepared  0.1  ‐  1%  sodium  hypochlorite  and  autoclaved  tap‐water  for  rinsing.  One  spore  capsule  per  species  was  transferred  to  a  sterile  petri  dish  with  1‐2  mL  sodium  hypochlorite  solution.  The  spore capsule was fixed with sterilized forceps, and opened  with  a  scalpel  by  use  of  a  stereo  microscope  under  sterile  conditions.  The  spores  were  kept  in  sodium  hypochlorite  solution for 1‐2 minutes. Subsequently, about 50–100 µL of  the  spore  suspension  was  transferred  (using  a  micro  pi‐

pette  with  filter  tips)  to  a  petri  dish  containing  1‐2  mL  autoclaved  tap  water.  After  10  minutes  of  washing,  100‐ 500  µL  of  the  spore  suspension  was  transferred  to  Knop  plates [250 mg L‐1 KH2PO4, 250 mg L‐1 MgSO4·7H2O, 250 mg  L‐1  KCl,  1000  mg  L‐1  Ca(NO3)2·4H2O,  12.5  mg  L‐1  FeSO4·7H2O;  pH  adjusted  to  5.8  with  KOH,  solidified  with  12  g  L‐1  purified  agar]  (BOX  1).  The  volume  of  spore  sus‐ pension  transferred  from  hypochlorite  solution  to  water  and  afterwards  to  the  Knop  agarose  plate  depends  on  the  number of spores per capsule (spore density) and needs to  be  adjusted  during  the  sterilization  procedure.  Finally,  the  petri dishes were enclosed with laboratory film (Nescofilm,  Roth,  Germany)  and  placed  in  the  climate  chamber  under  the  conditions  described  above.  After  germination  of  the  spores,  single  protonemal  filaments  were  isolated  with  a  sterile  needle  under  a  stereo  microscope  at  the  laminar  flow  bench,  and  transferred  to  a  fresh  Knop  agarose  plate  (Figure 1C).  

 

  Figure  1:  Different  bryophytes  in  axenic  in  vitro  culture.  (A)  Physcomitrella  patens  (Funariales,  Bryopsida)  with  spore  capsules  grown  on  autoclaved peat, (B) gemmae cups of Marchantia polymorpha, (C) isolated protonemal filament grown from a single spore of Encalypta strep­ tocarpa (Encalytpales, Bryopsida, scalebar = 1 mm). (D‐L) Bryophytes on Knop agarose plates, cultivated under standardized growth condi‐ tions (16h light, 8h dark, 70 μmol m‐2 s‐1 white light, 22° C); (D) Physcomitrella patens, (E) Physcomitrium pyriforme, (F) Atrichum undulatum,  (G) Plagiomnium undulatum, (H) Aulacomnium androgynum, (I) Rhynchostegium murale, (J) Brachythecium rutabulum, (K) Thuidium sp., and  the liverwort (L) Marchantia polymorpha, scalebars = 1 cm.      Journal of Endocytobiosis and Cell Research VOL 20 | 2010

103

Bryophyte in vitro culture, Beike AK et al.

Several  weeks  later,  sterility  controls  were  carried  out.  Here,  small  fragments  of  the  plant  material  were  trans‐ ferred  to  Knop  agarose  plates  supplemented  with  1%  glu‐ cose  (10  g  L‐1)  and  to  LB  [10  g  L‐1  bacto‐tryptone,  5  g  L‐1  yeast extract, 10 g L‐1 NaCl; pH adjusted to 7.0 with NaOH,  solidified  with  15  g  L‐1  bacto  agar]  agarose  plates.  The  sterile  controls  were  incubated  over  night  at  37  °C  and  subsequently kept for  at least  4 weeks to confirm that the  bryophyte cultures were axenic (BOX 2). 

  Sterilization of gametophores  Gametophytic  tissue  of  mosses  and  liverworts  was  steril‐ ized  with  1.5%,  1%,  or  0.75%  sodium  hypochlorite  for  1  minute,  respectively.  Optional sterilization  in  70%  ethanol  for  30  seconds  prior  to  sodium  hypochlorite  sterilization  might  be  conducted.  For  liverworts,  gemmae  (vegetative  propagules) are recommended (Figure 1B). Autoclaved tap‐ water was used for washing the material after surface ster‐ ilization  for  10  minutes.  The  sterilization  procedure  was  performed in 15 mL screw  cap tubes.  Afterwards the thal‐ lus  fragments  were  transferred  to  Knop  agarose  plates  supplemented with 1% glucose (10 g L‐1). Depending on the  species, transfer of the sterilized thallus fragments to Knop  agarose  plates  without  glucose  might  yield  better  results.  The  liverwort  Marchantia  polymorpha,  as  well  as  several  Funariaceae, were successfully transferred to Knop glucose  plates,  whereas  Thuidium  sp.  was  successfully  transferred  to  Knop  plates  without  glucose  only.  In  cases  where  only  small  amounts  of  plant  material  are  available,  e.g.  if  at‐ tempting in vitro cultivation of endangered species or her‐ barium material, we recommend to start with low concen‐ trations of sodium hypochlorite and transferring the steril‐ ized  fragments  onto  Knop  plates  without  glucose.  This  ensures that insufficiently sterilized plants are not immedi‐ ately  overgrown  with  contaminants  and  makes  it  possible  to  raise  new  plant  material  for  successive  sterilization  efforts. On the other hand, if enough plant material is avail‐ able, preparing a serial dilution of sodium hypochlorite and  carrying out the sterilization procedure at various concen‐ trations  is  preferable.  For  regeneration  of  the  plant  mate‐ rial,  the  plates were  placed  in  a  climate  cabinet  with  stan‐ dardized  long‐day  growth  conditions.  After  regeneration,  sterile  controls  using  LB  and  Knop  glucose  plates  were 

performed as described above for the sterilization of spores  (BOX2).    Gemmae induction for Marchantia polymorpha  For  Marchantia  polymorpha,  gemmae  formation  was  in‐ duced  by  placing  the  plants  on  common  mineral  medium  (Knop  or  0.5x  Gamborg’s  B5)  containing  1%  glucose  or  sucrose.  After  2‐3  weeks  gemmae  cups  (Figure  1B),  each  containing numerous gemmae, developed. To prepare them  for  subcultivation,  a  few  drops  of  autoclaved  tap  water  were  transferred  onto  a  fresh  Knop  plate.  Afterwards,  a  single  gemmae  cup  was  grasped  with  sterile  forceps  and  gemmae were spread onto the surface of the Knop plate by  means of suspension via the water droplets. Subsequently,  the petri dish was enclosed with laboratory film and culti‐ vated  at  standard  long‐day  conditions  (Okada  et  al.  2000;  Takenaka et al. 2000; Ishizaki et al. 2008).    Cultivation on different substrates  In addition to cultivation on mineral medium, axenic bryo‐ phytes were grown on peat and sea sand. Sea sand can be  used  for  standardized  axenic  or  non‐axenic  cultures  of  bryophytes as previously described (Frahm and Nordhorn‐ Richter  1984).  For  axenic  in  vitro  cultivation,  moistened  peat  and  sea  sand  were  autoclaved  in  Magenta®  boxes  (Sigma  Aldrich,  Germany)  prior  to  use.  Peat  was  sterilized  two  times  with  an  intermittent  overnight  resting  period,  enabling  germination  and  subsequent  sterilization  of  spores.  Axenic  moss  material  was,  depending  on  the  spe‐ cies, transferred to autoclaved peat or sea sand under ster‐ ile  conditions. The  cultivation on peat is depending on the  pH requirements of the species in question (i.e., basophilic  or  acidophilic),  and  might  be  not  recommendable  for  all  species.  The  boxes  were  enclosed  with  laboratory  film.  Starting e.g. from protonemal cultures in liquid medium, P.  patens was cultivated on sand, peat and Knop; peat proved  to be more applicable than sea sand (Figure 2). As an alter‐ native  to  Magenta®  boxes,  we  found  Weck®  glass  jars  (Weck,  Germany),  e.g.  commonly  used  to  preserve  jam,  suitable for cultivation as well (Figure 3). Weck® jars were  also  enclosed  with  laboratory  film,  allowing  gas  exchange  while avoiding desiccation. 

 

 

 

Figure 2: Physcomitrella patens grown axenically on (A) solid Knop medium, (B) autoclaved sea sand, (C) autoclaved peat; scalebar = 1 cm. 

104

Journal of Endocytobiosis and Cell Research VOL 20 | 2010

Bryophyte in vitro culture, Beike AK et al.

Figure 3: Mosses grown axenically in Weck® glass jars. (A)  Aula­ comnium  androgynum  on  solid  Knop  medium,  (B)  Plagiomnium  undulatum on peat/sand mixture. 

Concluding remarks  Axenic  in  vitro  cultivation  of  bryophytes  enables  standar‐ dized cultivation allowing precise experimental setups, e.g.  for  transcriptomics,  physiology  or  evo‐devo  questions.  Moreover,  axenic  culture  is  a  prerequisite  for  analysis  as  well  as  biotechnological  production  of  metabolic  com‐ pounds.  The  development  of  the  moss  P.  patens  and  the  liverwort  M.  polymorpha  into  model  organisms  was  enabled  by  establishment  of  axenic  in  vitro  culture  tech‐ niques. The methods presented in this technical note can be  used  to  establish  further  bryophyte  model  organisms  for  basic as well as applied research.     

Acknowledgements  This work was supported by the University of Freiburg, the  Ministry of Science, Research and Art of the Federal State of  Baden‐Württemberg  (RiSC  grant  to  SAR)  and  by  the  Ger‐ man Federal Ministry of Education and Research (Freiburg  Initiative  for  Systems  Biology,  FKZ  0313921  to  SAR).  We  are  grateful  to  Jan‐Peter  Frahm  and  Michael Lüth  for their  help  on  collecting  and  determining  bryophyte  species,  Sebastian  Hanke  for  providing  an  image  of  Marchantia  polymorpha, and to Takayuki Kohchi for providing M. poly­ morpha L. Tak‐1 and BC4 gemmae. 

    References  Asakawa  Y.  (1981)  Biologically  active  substances  obtained  from  bryophytes. J Hattori Bot Lab. 50:123‐142.  Asakawa  Y.  (2007)  Biologically  active  compounds  from  bryo‐ phytes*. Pure Appl Chem. 79:557–580.  Ashton NW, Cove DJ. (1977) The isolation and preliminary charac‐ terization  of  auxotrophic  mutants  of  the  moss,  Physcomitrella  patens. MOI. Gen Genet. 154:87‐95.  Beike  AK,  Decker  EL,  Frank  W,  Lang  D,  Vervliet‐Scheebaum  M,  Zimmer AD, Reski R. (2010) Applied Bryology – Bryotechnology.  Trop Bryol. 31:22‐32.  Cove DJ. (2005) Physcomitrella patens. Annu Rev Gen. 39:339‐358. 

Journal of Endocytobiosis and Cell Research VOL 20 | 2010

Cove  DJ,  Bezanilla  M,  Harries  P,  Quatrano  RS.  (2006)  Mosses  as  model  systems  for  the  study  of  metabolism  and  development.  Annu Rev of Plant Biol. 57:497‐520.  Cove  DJ,  Perroud  PF,  Charron  AJ,  McDaniel  SF,  Khandelwal  A,  Quatrano RS. (2009) Culturing the moss Physcomitrella patens.  Cold Spring Harb Protoc. 2009: pdb.  Decker  EL,  Reski  R.  (2004)  The  moss  bioreactor.  Curr  Opin  Plant  Biol. 7:166‐170.  Duckett JG, Burch J, Fletcher PW, Matcham HW, Read DJ, Russell AJ,  Pressel SI. (2004) In vitro cultivation of bryophytes: a review of  practicabilities,  problems,  progress  and  promise.  J  Bryol.  26:3‐ 20.  Frahm  J‐P,  Nordhorn‐Richter G.  (1984) A standardized method  for  cultivating bryophytes. Bryol Times. 28:3‐5.  Frank  W,  Decker  EL,  Reski  R.  (2005)  Molecular  tools  to  study  Physcomitrella patens. Plant Biol. 7: 220‐227.  Graham  LE,  Cook  ME,  Busse  JS.  (2000)  The  origin  of  plants:  body  plan  changes  contributing  to  a  major  evolutionary  radiation.  Proc Natl Acad Sci USA. 97:4535‐4540.  Hohe A, Rensing SA, Mildner M, Lang D, Reski R. (2002) Day length  and temperature strongly influence sexual reproduction and ex‐ pression  of  a  novel  MADS‐Box  gene  in  the  moss  Physcomitrella  patens. Plant Biol. 4:762‐762.  Hohe A, Reski R. (2002) Optimisation of a bioreactor culture of the  moss  Physcomitrella  patens  for  mass  production  of  protoplasts.  Plant Sci. 163:69‐74.  Hohe A, Reski R. (2005) From axenic spore germination to molecu‐ lar farming: one century of bryophyte in vitro culture. Plant Cell  Rep. 23:513‐521.  Ishizaki K, Chiyoda S, Yamato KT, Kohchi T. (2008) Agrobacterium‐ mediated  transformation  of  the  haploid  liverwort  Marchantia  polymorpha  L.,  an  emerging  model  for  plant  biology.  Plant  Cell  Physiol. 49:1084‐1091.  Kenrick  P,  Crane  PR.  (1997)  The  origin  and  early  evolution  of  plants on land. Nature. 389:33‐39.  Lang D, Eisinger J, Reski R, Rensing SA. (2005) Representation and  high‐quality  annotation  of  the  Physcomitrella  patens  transcrip‐ tome  demonstrates  a  high  proportion  of  proteins  involved  in  metabolism among mosses. Plant Biol. 7:228‐237.  Okada S, Fujisawa M, Sone T, Nakayama S, Nishiyama R, Takenaka  M, Yamaoka S, Sakaida M, Kono K, Takahama M, Yamato KT, Fu‐ kuzawa H, Brennicke A, Ohyama K. (2000) Construction of male  and female PAC genomic libraries suitable for identification of Y‐ chromosome‐specific clones from the liverwort, Marchantia po­ lymorpha. Plant J. 24:421‐428.  Prigge  MJ,  Bezanilla  M  (2010)  Evolutionary  crossroads  in  deve‐ lopmental  biology:  Physcomitrella  patens.  Development.  137:  3535‐3543  Rensing  SA,  Lang  D,  Zimmer  AD,  Terry  A,  Salamov  A,  Shapiro  H,  Nishiyama  T,  Perroud  PF,  Lindquist  EA,  Kamisugi  Y,  Tanahashi  T,  Sakakibara  K,  Fujita  T,  Oishi  K,  Shin  IT,  Kuroki  Y,  Toyoda  A,  Suzuki  Y,  Hashimoto  SI,  Yamaguchi  K,  Sugano  S,  Kohara  Y,  Fu‐ jiyama A, Anterola A, Aoki S, Ashton N, Barbazuk WB, Barker E,  Bennetzen  JL,  Blankenship  R,  Cho  SH,  Dutcher  SK,  Estelle  M,  Fawcett  JA,  Gundlach  H,  Hanada  K,  Heyl  A,  Hicks  KA,  Hughes  J,  Lohr  M,  Mayer  K,  Melkozernov  A,  Murata  T,  Nelson  DR,  Pils  B,  Prigge M, Reiss B, Renner T, Rombauts S, Rushton PJ, Sanderfoot  A, Schween G, Shiu SH, Stueber K, Theodoulou FL, Tu H, Van de  Peer Y, Verrier PJ, Waters E, Wood A, Yang L, Cove D, Cuming AC,  Hasebe  M,  Lucas  S,  Mishler  BD,  Reski  R,  Grigoriev  IV,  Quatrano  RS, Boore JL. (2007) The Physcomitrella Genome Reveals Evolu‐ tionary  Insights  into  the  Conquest  of  Land  by  Plants.  Science.  319:64‐69.  Reski  R.  (1998)  Development,  genetics  and  molecular  biology  of  mosses. Bot Acta. 111:1‐15.  Reski  R.  (2003)  Physcomitrella  patens  as  a  novel  tool  for  plant  functional genomics. In: Vasil IK. (ed) Plant biotechnology 2002  and beyond. Kluwer Acad. Publ., pp 205‐209.  Reski  R,  Abel  WO.  (1985)  Induction  of  budding  on  chloronemata  and  caulonemata  of  the  moss,  Physcomitrella  patens,  using  iso‐ pentenyladenine. Planta. 165:354‐358.  Saavedra  L,  Svensson  J,  Carballo  V,  Izmendi  D,  Welin  B,  Vidal  S.  (2006) A dehydrin gene in Physcomitrella patens is required for  salt and osmotic stress tolerance. Plant J. 45:237‐249. 

105

Bryophyte in vitro culture, Beike AK et al.

Schween G, Gorr G, Hohe A, Reski  R. (2003) Unique tissue‐specific  cell cycle in Physcomitrella. Plant Biol. 5:50‐58.  Takenaka  M,  Yamaoka  S,  Hanajiri  T,  Shimizu‐Ueda  Y,  Yamato  KT,  Fukuzawa H, Ohyama K. (2000) Direct transformation and plant  regeneration of the haploid liverwort Marchantia polymorpha L.  Trans Res. 9:179‐185.  Taylor TN, Kerp H, Hass H. (2005) Life history biology of early land  plants:  deciphering  the  gametophyte  phase.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA. 102:5892‐5897. 

106

Wolf L, Rizzini L, Stracke R, Ulm R, Rensing SA. (2010) The molecu‐ lar and physiological response of Physcomitrella  patens to UV‐B  radiation. Plant Physiol. 153:1123‐1134.  Zimmer  A,  Lang  D,  Richardt  S,  Frank  W,  Reski  R,  Rensing  SA.  (2007) Dating the early evolution of plants: detection and mole‐ cular  clock  analyses  of  orthologs.  Mol  Genet  Genom.  278:393‐ 402.  Zinsmeister  HD,  Becker  H,  Eicher  T.  (1991)  Moose,  eine  Quelle  biologisch  aktiver  Naturstoffe?  Angewandte  Chemie.  103:134‐ 151.

Journal of Endocytobiosis and Cell Research VOL 20 | 2010

Bryophyte in vitro culture, Beike AK et al.

BOX 1 – Media and solutions    Knop. 

Preparation of Knop stock solutions – Prepare Knop stock solutions as described. Solutions 1‐4 should  be autoclaved. Solution 5 must not be autoclaved, but stored at 4°C. Please note that chemicals used  must not be ultra‐pure, otherwise necessary micro minerals are lacking.  

  Knop stock solution 1    Components  Amount Stock conc. Ca(NO3)2·4 H2O  100 g 423 mM Add water to final volume of 1000 mL    

Components  KCl

Knop stock solution 2    Amount Stock conc. 25 g 335mM Add water to final volume of 1000 mL

    Knop stock solution 3    Components  Amount Stock conc. KH2PO4  25 g 184 mM Add water to the final volume of 1000 mL    

Components  MgSO4·7 H2O 

Knop stock solution 4    Amount Stock conc. 25 g 101mM Add water to final volume of 1000 mL

   

Components  FeSO4·7 H2O      Knop. 

Knop stock solution 5    Amount Stock conc. 250 mg 899 µM Add water to final volume of 1000 mL

Preparation of solid Knop cultivation medium – Solid Knop medium is prepared using stock solutions  (1‐5) and subsequently autoclaved. Here, 10 mL of stock solutions 1‐4, and 50 mL of stock solution 5  are transferred to an 1 L bottle. The pH is adjusted to 5.8 with 1 M KOH. For solidification, 12 g puri‐ fied agar (Oxoid, Cambridge, UK) is added and the final volume adjusted to 1 L with deionized water.  Medium  containing  agarose  can  be  stored  temporarily  at  65°C  after  autoclaving,  prior  to  pouring  plates.  

Journal of Endocytobiosis and Cell Research VOL 20 | 2010

107

Bryophyte in vitro culture, Beike AK et al.

BOX 2 – Axenic in vitro cultivation of bryophytes    Surface sterilization of gametophytic tissue  Step 1 

Collection and determination of plant material ‐ Gemmae and thallus fragments were collected in the  field. Species determination can be performed with a bryological field guide. 

Step 2 

Cleaning of plant material – Rinse collected plant material with tap water to remove soil and debris in  a petri dish under a stereo microscope. 

Steps 3­8 are performed under sterile conditions at a laminar flow bench.  Step 3 

Preparation for sterilization ‐ Use sterilized forceps to pick small fragments of tissue. Take many single  fragments, since not all fragments will survive sterilization and not all fragments will be axenic. Use  freshly sterilized forceps and separate autoclaved tap water pools for each fragment. 

Step 4 

Optional sterilization step with 70% ethanol – Immerse tissue for 30 seconds in 70% ethanol. 

Step 5 

Surface  sterilization  with  sodium  hypochlorite  solution  –  Immerse  tissue  for  1  minute  in  0.75  ‐  1.5%  sodium hypochlorite solution.  

Step 6 

Washing step – Wash tissue for 10 minutes in autoclaved tap water. Wash each thallus fragment in a  separate tube and use freshly sterilized forceps, respectively. 

Step 7 

Transfer plant material to culture medium ‐ Place thallus fragments on Knop plates or on Knop agarose  plates with 1% glucose (10 g L‐1). Wrap petri dishes with laboratory film (Nescofilm, Roth, Germany)  and place them in a climate chamber under long‐day conditions (16h light, 8h dark, 70 μmol m‐2 s‐1,  22°C).  

Step 8 

Sterile controls – Make sterile controls of your cultures by either taking a swap with sterile forceps or  by  transferring  small  amounts  of  sterilized  plant  material  to  both  sterile  control  media  (Knop  with  glucose and LB). Enclose sterile controls with laboratory film and incubate over night at 37°C. 

Step 9 

Routinely check for contaminations for at least four weeks. 

  Surface sterilization of spores and sporophytes  Step 1 

Collection  and  determination  of  plant  material  ‐  Mature  spore  capsules  were  collected  in  the  field.  Species determination can be performed with a bryological field guide. 

Step 2 

Cleaning of plant material – Rinse collected spore capsules with tap water to remove soil and debris in  a petri dish under a stereo microscope. 

Steps 3­7 are performed under sterile conditions at a laminar flow clean bench. 

108

Step 3 

Surface  sterilization  with  sodium  hypochlorite  solution  –  Transfer  a  single  capsule  into  a  petri  dish  containing  1  –  2  mL  sodium  hypochlorite  solution.  Open  the  capsule  with  a  scalpel  and  keep  the  spores  for  1  minute  in  0.1  ‐  1%  sodium  hypochlorite  solution.  Subsequently,  transfer  50‐100  µL  of  spores suspension to 1‐2 mL autoclaved tap water in another petri dish. We recommend to wash each  batch of spores in a separate petri dish. 

Step 4 

Washing step – Wash the spores for 10 minutes in autoclaved tap water in a sterile petri dish.  

Step 5 

Transfer spore solution to culture medium – Transfer 100 – 500 µL of spore suspension to a Knop aga‐ rose plate by pipetting with filter tips. Enclose the petri dishes with laboratory film and place them in  a climate chamber under under long‐day conditions (16h light, 8h dark, 70 μmol m‐2 s‐1, 22°C).  

Step 6 

Isolation  of  single  protonemal  filaments  (optional;  to  ensure  clonal  lines)  –  after  germination  of  the  spores transfer single protonemal filaments with a needle to a fresh Knop agarose plate.  

Step 7 

Sterile controls – Make sterile controls of your cultures by either taking a swap with sterile forceps or  by transferring small amounts of sterilized plant material to both sterile control media. Enclose sterile  controls with laboratory film and incubate over night at 37°C. 

Step 8 

Routinely check for contaminations for at least four weeks. 

Journal of Endocytobiosis and Cell Research VOL 20 | 2010